|
本研究は、腸管病原性大腸菌(EPEC)が宿主細胞と接触することで発現される遺伝子群を、cre-loxPシステムを利用したスクリーニング系で同定した後、これをレポーターとし、ランダム変異導入法と組み合わせることによって、宿主との接触依存性に発現する細菌遺伝子の「制御因子」を同定しようとするものである。
本年度は特に、このスクリーニングに用いるベクター及びレポーター菌株を調製する目的で以下の成果を得た。
1.クローニングベクター構築
計画通りプロモーターのないcre遺伝子をベクターに配置し、EPEC遺伝子断片をクローニングできるベクターの作成を完了した。
2.ターゲッティングベクター(T.V.)の構築
EPEC染色体上の16SリボゾームRNA遺伝子内に「loxP-sacB-tet^R-loxP」カセット配列を相同組み替えにより挿入する計画を実行した。作成したカセット配列の作成をEPECよりクローニングした16SリボゾームRNA遺伝子内に挿入し、ターゲッティングベクター(T.V.)の調製を完了した。
3.レポーター菌株の調製
T.V.を用いて、EPEC野生株染色体上の16SリボゾームRNA遺伝子領域にカセット配列を挿入しようとしたが、目的のクローンを得ることができていない。詳細に検討した結果、作成したDNA配列が高次構造をとらないよう、カセット配列内の遺伝子の向きを変更したり、cre-loxPシステム同様の配列特異的相同組み替えシステムであるflp-FRTをシステム利用する必要のあることが示唆された。
|
