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C型慢性肝炎再発患者の血清からRNAを抽出しlong RT-PCR法にてHCV非構造領域のcDNA(遺伝子型1b)を増幅した。これをHCVサブゲノムレプリコンカセットへ挿入し、in vitro転写法によりRNAを合成しHCVサブゲノムレプリコンライブラリーを作製した。このライブラリーRNAを培養肝癌細胞Huh-7へとランスフェクションし、ネオマイシン存在下で3週間培養した。その結果9個のHCVサブゲノムレプリコン複製細胞が樹立できた。ネオマイシンとインターフェロンを同時に投与するとこれらはすべて死滅し、サブゲノムレプリコンが実際に複製していること、さらに、これらがインターフェロン感受性を有することが示された。
そのうちの一つの細胞クローンをネオマイシン存在下で培養し、そこからlong RT-PCR法にてHCV非構造領域のcDNAを増幅し、さらにプラスミドカセットへ再挿入しサブゲノムレプリコンプラスミド(pSGT5)を樹立した。pSGT5からRNAを作製しHuh-7細胞ヘトランスフェクトすると、もとのライブラリ治に比べ数百倍のコロニーが得られ、pSGT5が非常に複製効率の良いサブゲノムレプリコンであることが示された。
次にlong RT-PCR法にて同じ血清からHCV構造領域のcDNAも増福し、pSGT5へ挿入し、HCV全長レプリコンRNAライブラリーを作製した。これをHuh-7細胞ヘトランスフェクトすると、細胞内でコアタンパクの発現が認められた。今後、これが全長HCVの複製によるものか確認する予定である。また、樹立済みのsuper-permissiveなHuh7細胞クローンへもトランスフェクトしHCV憾染性クローンの樹立を試みることを計画している。
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