| 研究課題/領域番号 |
18590556
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
李 明鎭 神戸大学, 医学系研究科, 講師 (20273766)
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| 研究分担者 |
西尾 久英 神戸大学, 医学系研究科, 教授 (80189258)
綾木 仁 神戸大学, 医学系研究科, 助教授 (80222701)
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| キーワード | スプライシング関連蛋白 / Cd / in vitroスプライシング / SMN遺伝子 |
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| 研究概要 |
申請者らはスプライシング反応に必須である未知のスプライシング関連蛋白を検出・同定し、その機能を解析するため、蛋白中の亜鉛(Zn)と置換し蛋白の活性を変動させるカドミウム(Cd)の性質を利用した研究を計画した。
1.Cd投与によりスプライシング変異体が誘導される遺伝子の同定
1〜100μMのCdCl_2を9時間投与したSMA患者由来のfibroblast、COS7、HeLa及びMCF7細胞株のmRNAを用いてRT-PCRを行い、SMN遺伝子とBRCA1、BRCA2遺伝子のスプライシング変異体の発現量を調査した。その結果、SMA患者のfibroblast細胞において、100μMのCd投与によりSMN遺伝子のexon7が排除されたmRNAが増加することを見出した。このことで、CdがSMN遺伝子のスプライシング反応を撹乱する可能性があると推測された。他の細胞や遺伝子においては、変化は見られなかった。
2.One-intron systemのin vitroスプライシング解析
SMN1遺伝子のexon6-intron6-exon7を含むミニ遺伝子を用いてin vitroスプライシングを行った。反応液中のZn排除により停止したスプライシング反応は、Cd投与によって高い効率で回復された。この結果で、Znと結合して機能する未知のスプライシング関連蛋白が、スプライシングにおいて必須であること、それからZnに代わってその蛋白に結合できるCdが、スプライシングの制御を混乱させる可能性が示唆された。
3.Two-intron systemのミニ遺伝子の構築
Cdによるexon7排除の変動を確認するため、SMN1遺伝子のexon6-intron6-exon7-intror7-exon8を含むミニ遺伝子をoverlap extension PCR法を用いて作製した。
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