| 研究課題/領域番号 |
18590757
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
蒔田 直昌 北海道大学, 北海道大学病院, 講師 (00312356)
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| 研究分担者 |
望月 直樹 国立循環器病センター研究所, 循環器形態部, 部長 (30311426)
塩島 一朗 千葉大学, 医学系研究科, 客員助教授 (90376377)
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| キーワード | Akt / リン酸化シグナル / Naチャネル / トランスジェニック動物 |
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| 研究概要 |
1.AktおよびAkt-3Aプラスミドの作成
ヒトNav1.5のAktリン酸認識配列を破壊した変異(S486A、S663A)と、それぞれのN末端にFLAGタグをつけたNaチャネルプラスミドを作成した。供与をうけたヒトAktおよびAktの不活化変異Akt-3A(K179A+T308A+S478A)のcDNAの一部に入っていた変異を修正したうえで、AktとCD8をプラスミドpIRESの別々の読み取り枠にサブクリーニングした。
2.心筋NaチャネルSCN5Aに対するAktの機能修飾
Nav1.5とAktまたはAkt-3Aプラスミドを培養細胞にトランスフェクションし、whole-cellパッチクランプでNa電流を測定・解析した。AktはNaチャネルの電流量を増加させるが、その後の詳細な検討から、Naチャネルのキネティックスは大きく変えないことが判明した。
3.NaチャネルのAktリン酸化に関する免疫生化学的検討
AktとそのホモログSGKがNaチャネルをin vitroでリン酸化するかどうか検討した。FLAGを付加したNav1.5融合タンパクをAktまたはSGKとHEK293細胞にトランスフェクションし、抗FLAG抗体で免疫沈降し、抗Aktリン酸化基質抗体でウェスタンブロッティングした。AktおよびSGKがNaV1.5をリン酸化することを確認した。
4.Aktトラスジェニックマウス(TGM)の心電図記録
Akt TGMの心電図記録はH19年度に行う予定である。
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