研究概要 |
本研究はsteroidogenic acute regulatory protein (StAR)のステロイドホルモン生合成におけるコレステロール転送機構を解明することを最終的な目標とし,in vivoにおけるStAR構造機能解析系の確立を目指すものである.当該期間においては,下記の経緯で,野生型マウスStar遺伝子を含む細菌人工染色体(Star WT BAC)をrecombinase A発現大腸菌内で相同組み換えにより修飾し,Star遺伝子転写調節領域により誘導される緑色蛍光蛋白質(eGFP)レポーター遺伝子導入マウス(Star/eGFPマウス)のコンストラクトを完成させた. 1)Star遺伝子翻訳開始コドンの上下流500bpの相同領域A, BでeGFP cDNA, bGH polyAを挟んだ2kbの領域をrecombinase A,テトラサイクリン耐性遺伝子,温度感受性oriを持つpSV1.RecAヘライゲートし,シャトルベクターpSV1.RecA.A.eGFP.bGHpolyA.Bを作成した. 2)StarWTBAC導入大腸菌にシャトルベクターpSV1.RecA.A.eGFP.bGHpolyA.Bを導入し,クロラムフェニコール,テトラサイクリン,温度感受性で選択して,Star WT BACの相同領域AないしBへpSV1.RecA.A.eGFP.bGHpolyA.Bが挿入されたco-integrated BACを同定した. 3)Co-integrated BACをクロラムフェニコールと温度感受性で選択し2回目の相同組み換えを誘導して,さらにクロラムフェニコールとフサル酸感受性で選択してStar/eGFP BACを同定した. 4)Star/eGFP BACのサイズ・構成をPFGE・サザンプロット・シーケンスで確認し,CsCl密度勾配遠心法で精製し,Star/eGFPマウスのコンストラクトとした.
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