研究課題
基盤研究(C)
研究者は原発性免疫不全症に対する造血幹細胞遺伝子治療の際に使用される臨床用レトロウイルスベクター産生のために、以下の研究を期間内に行った。1)慢性肉芽腫症原因遺伝子ヒトCYBB遺伝子のクローニング:対象疾患である慢性肉芽腫症は食細胞のNADPHオキシダーゼ酵素の構成タンパク質である gp91Phoxをコードするcytochrome b558 heavy chain gene (CYBB)遺伝子に変異のある疾患である。健常人多核球よりmRNAを調整し、PCR法にてgp91Phoxのopen reading frameを増幅し、クローニング後のDNA sequence法に1603塩基対の配列を確認した。2) gene silencing 抵抗性レトロウイルスベクターGCDNsapの構築:研究者がすでに臨床用ベクターとして構築しているGCsap(PCMV)内の2ヶ所の抑制性転写因子結合領域(YY1 および Trim28 結合部位)に変異を入れたGCDNsapを構築した。このベクターは未熟細胞においても著しいgene silencing抵抗性を示し、造血幹細胞や胚性幹細胞においても長期にわたる導入遺伝子の発現維持を可能にしている。3) 臨床用ウイルス産生細胞の樹立:上記GCDNsapにクローニングしたCYBB遺伝子を組込み、水庖性口内炎ウイルスのGタンパク質を発現する293gpgに導入することで、gp91^<phox>発現レトロウイルスベクター産生細胞を樹立した。このウイルス力価は、ヒトT細胞株であるJurkat細胞にて2.0x10^5m1/I.U.程度であった。4) 遺伝子導入細胞におけるgp91^<phox>発現:上記、遺伝子導入Jurkat細胞において、細胞表面および細胞内にgp91^<phox>の発現をFACSにて確認した。現在、ヒト造血前駆細胞であるCD34陽性細胞への遺伝子導入実験を行っており、良好な結果が得られている。
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