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ケノデオキシコール酸(CDCA)は過量に存在するとFas pathwayを介して肝細胞のアポトーシスを誘導する。一方、cow pox由来のCrmA蛋白は、Caspase1と8を阻害することでFas pathwayを阻害し、抗アポトーシス作用を有する。レシピエント肝細胞のアポトーシスの誘導に過量のCDCAを用い、一方、ドナー肝細胞に抗アポトーシス作用を有するCrmA蛋白を導入する。CrmA遺伝子を、CDCAにて活性化されるIntestinal bile acid binding protein(I-BABP)promoterの下流に挿入し、過量のCDCA存在下でのみ発現するようにする。過量のCDCAを投与されたレシピエント肝内で、CrmA遺伝子導入されたドナー肝細胞が再増殖することを目的とし、本年度は以下の基礎的項目を確認した。
1.CrmA遺伝子を、CDCAにて活性化されるIntestinal bile acid binding protein(I-BABP)promoterの下流に挿入し、過量のCDCA存在下のみCrmA蛋白が発現する遺伝子断片を作製する。
(1)Mouse Intestinal bile acid binding protein(I-BABP)promoter領域をPCRにて増幅し、クローンを得た。
(2)このI-BABP promoterがCDCAにて活性化されることを、ルシフェラーゼをレポーターとして確認した。
(3)I-BABP promoterの下流にEGFP遺伝子、CrmA遺伝子を挿入し、過量のCDCA存在下でのみEGFP-CrmA融合蛋白が発現されることを蛍光顕微鏡、ウエスタンブロット法にて確認した。
2.HepG2細胞にI-BABP promoter-EGFP-CrmA遺伝子断片を導入することで、HepG2細胞がCDCAによるアポトーシス誘導に抵抗性になることをin vitroで確認した。
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