| 研究概要 |
「軟骨細胞の分裂・増殖・分化を方向付ける外的因子と受容体、細胞内シグナル機構、転写因子、産出される蛋白質などの同定を指標にして、各分化時期の細胞に炎症性サイトカイン(IL-1β,IL-6,TNFα,IFNγ,IL-18)を加えその変化を観察し、炎症性サイトカインの成長阻害の機構を明らかにする」ことを目的として、以下の検討を行った。
1)cell line:C2C12細胞の培養・分化における至適件の確定と炎症性サイトカインの影響の検討
・C2C12細胞に対し、軟骨細胞分化に伴う細胞外因子としてVEGF、FGFR3、chondromudulin(CM)などに対して炎症性サイトカインIL-1β、IL6、TNFαを共存させることで各分化時期における産出蛋白量の変化を測定しその影響を観察する。現在、それぞれの濃度、培養時間についての検討を進めた。
2)サイトカインによる急性蛋白(CRP血清アミロイドA(SAA))ペントラキシン3(PTX3)シクロオキシゲナーゼ(Cox2)の誘導
・ヒト肝細胞株(HepG2,Hep3B)、ヒト内皮細胞(HUVEC)、ヒト平滑筋細胞(primary culture)、ヒトマクロファージ(M-1)を用いて、IL-6,IL-1,TNF-αによるCRP,SAA,PTX3,Cox2の発現をそれぞれの特異プライマーを用いたreal time RT-PCRにて測定した。
・サイトカイン特異抗体を用いた阻害実験:サイトカインの有無の直接作用の検討のため、上記の系にサイトカイン特異阻害剤(抗IL-6受容体抗体、抗TNF-α抗体、IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra))等を用いて発現阻害をみた。
・サイトカインシグナル伝達阻害剤を用いた発現経路の同定:IL-1,TNF-α経路の阻害剤として、NF-κB阻害剤(SN50)、AP-1阻害(SP600125)、P38阻害剤(SB203580)を、IL-6経路阻害剤としてMEK-1阻害剤(UO-126)、JAK/STAT3阻害剤(AG490)等を用いて上記炎症関連遺伝子のmRNA発現の阻害を検討した。
以上の検討をもとに、平成19年度の本研究を現在実施している。
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