研究課題
基盤研究(C)
申請者らは、m-calpainの阻害により細胞死を誘導するためには、その機序を詳細に知る必要があると考え、様々な分裂期異常後の細胞死のモデルを用いて、その分子生物学的な解析を試みた。まず、m-calpainが分裂期に限定分解を行う基質ではないかと考えているKidについてHeLa細胞でRNAiを行った。48時間後の培養細胞の透過光観察で既に核型の異常が認められ、二核や三核を持つ細胞が増加していた。これらの細胞は明らかな分裂期の遅延は呈さなかったが、核異刑と細胞質の増大を認め、分裂しないままに分裂期を生化学的に終了して、新たなG1期に突入したものと見られた。さらにそのまま観察を続けると、120時間後には多くの細胞が断片化を伴った細胞死に至った。フローサイトメトリーでも、早期には多倍体細胞の増加、後期にはS期の細胞の減少と細胞死の増加が認められた。また、KidのRNAi処理から72時間後にEg5阻害剤モナストロールで細胞を処理すると、モノポーラー細胞が観察されるものの、コントロールと比べて、中心付近に染色体の存在しない領域がなく、polar ejection forceの低下が認められた。これは、既に報告されている中和抗体を用いた実験と同様の結果であり、申請者らが報告したm-calpain阻害時とも同様である。このように、m-calpainとKidの関係性は強く示唆されたが、これらの活性や機能を阻害したことで、なぜ細胞死が起こるのかを明らかにせねば、臨床での応用は不可能である。Kidに対するRNAiの透過光観察やフローサイトメトリーの結果から、Kidを阻害すると、細胞は一度多倍体の状態となった後、細胞死に向かうと思われた。多倍体となった細胞がどのような機序で細胞死に至るのかを観察するために、さらに単純に細胞を多倍体化できるモナストロール処理の系を用いた実験を試みることとし、まず単純に投与濃度を振って様々な細胞をモナストロールで処理し、経時的に形態や染色体コピー数の観察などを行なった。その結果、有効濃度のモナストロールで細胞を処理した場合、96時間後には不死化ヒト正常線維芽細胞細胞であるhTERTMRC5は分裂期停止・細胞死とも少なく、不死化ヒト胎児腎細胞HEK293では分裂期停止がやや多いが細胞死は少なかった。さらに大腸癌細胞株であるHCT116では、p53正常株ではほとんどが細胞死に至り、対照的にp53欠損株では細胞死が少なく細胞のサイズが拡大していた。フローサイトメトリーでは、HEK293、HCT116p53koでは他の細胞では認めなかった8N、16Nといった多倍体化した細胞集団が認められた。この結果から、モナストロールによる多倍体化と細胞死の関連にはすでに報告されているようにp53が関与するチェックポイントが存在することが確認された。しかし、細胞がオクタプロイド、ヘキサテカプロイドと進むにつれ、p53の存在しない細胞においても多くの細胞死が誘導された。このことは、多倍体化が進むと、テトフプロイドまでとは異なり、p53非依存性のチェックポイントないしは細胞死の機序が存在することを示唆する。このような過剰に多倍体化した細胞群は、透過光観察において細胞質に空胞状の構造を多数認め、文献的考察からautophagyが細胞死に関与している可能性が考えられた。これらの構造がautophagosomeであることが証明され、生科学的にautophagyの誘導が証明できれば、過剰に多倍化した細胞における細胞死がautophagic cell deathであるといえる。このことに関しては、現在のところ証明できていない。
すべて 2007 2006
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Gastric Cancer vol.10:1
ページ: 35-8
Gastric Cancer vol.10:2
ページ: 135-9
Gastric Cancer vol.10, 1
Gastric Cancer vol.10, 2
臨床と研究 83・5
ページ: 35-40
