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実験1.GADD45bトランスジェニック・マウスの作成
DNAの設計および作成を行った。
1.Tet-off systemによりテトラサイクリンに応答し、GADD45bの遺伝子発現を抑制するpromoterを作成した。
2.軟骨に特異的に発現することを目的にTet-responsive transcriptional activatorを発現するvectorを作成した。
3.これらの遺伝子を導入した2系列のマウスを外部業者に作成依頼した(DNAフラグメントの調整、マイクロインジェクション)。今後動物の産生、スクリーニングを行う予定である。
実験2.免疫沈降法とSELDI-TOF MS法による新規GADD45b結合蛋白の同定
293cellを用いたGADD45b-Flag/pCDNA3.1vectorを過剰発現した細胞内蛋白を、Anti-Flag conjugated agarose beadsにて免疫沈降し、SDS-polyacrylamide gelに泳動した蛋白を、Ciphergen Protein Biology System(PBSII)にてSELDI-TOF MS解析した。
(結果)新規の結合蛋白としてElongation factor laを同定した。この分子は、細胞の蛋白合成調節を司る分子で細胞周期にも関わり、軟骨細胞の機能を検討する上で魅力的な蛋白である。今後、結合部位の同定と、機能について、順次研究を進める予定である。
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