| 研究概要 |
われわれはこれまでにBcl-2ファミリーに属するアポトーシス誘導分子Bimが破骨細胞のアポトーシスに重要な役割を果たすことを明らかにしている。初年度はBimに拮抗する抗アポトーシス分子のBcl-2ファミリーについて検討を加えた。
(1)マウス破骨細胞におけるBcl-2ファミリー分子の役割の検討
Bcl-2 familyにはanti-apoptotic familyであるBcl-2,Bcl-xL,Mcl-1,A1、proapoptotic familyであるBax,Bak,Bad,Bid,Puma,Noxaなど多数の分子が属する。これらの分子はお互いに相互作用しながら、アポトーシス調節蛋白複合体として細胞のアポトーシスを制御している可能性がある。本研究においてはレトロウイルスを用いた遺伝子高発現系、siRNAを用いた遺伝子ノックダウンを用いて、これらのファミリーの破骨細胞における役割を個々に検討するとともに、ファミリー全体としての役割を統合的に理解する。
a)Bcl-2,Bcl-xLの破骨細胞における内因性の発現確認
マウス骨髄細胞を採取し、M-CSF、RANKL刺激で破骨細胞へ分化させ、経時的に各分子のmRNAの発現(リアルタイムPCR)と蛋白レベルの発現(ウエスタンブロッティング)を確認した。
b)Bcl-2ファミリーであるBcl-2,Bcl-xLのクローニング、サブクローニング
Anti-apoptotic Bcl-2ファミリーであるBcl-2,Bcl-xLのレトロウイルス発現ベクターを作成した。
c)small interfering RNA(siRNA)を用いたBcl-2、Bcl-xLの遺伝子発現抑制
遺伝子発現抑制系の実験のためBcl-2,Bcl-xLのsiRNAを作製し、遺伝子発現抑制をリアルタイムPCR,ウエスタンブロッティングで確認した。
d)Bcl-2ファミリーの破骨細胞分化・活性化・アポトーシスに対する影響
上記の方法で作成したレトロウイルスベクターを用いて、Bcl-2,Bcl-xLの過剰発現、遺伝子抑制が破骨細胞の生存に及ぼす影響を検討した。抗アポトーシス分子であるBcl-2,Bcl-xLを過剰発現すると破骨細胞の生存能は著明に亢進し、逆に遺伝子発現を抑制すると生存能が著明に減少した。
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