| 研究課題/領域番号 |
18591714
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
|---|
研究代表者 |
藤田 義人 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (90238593)
|
|---|
| 研究分担者 |
浅井 清文 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (70212462)
祖父江 和哉 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (90264738)
|
|---|
| キーワード | RNAi / アクアポリン / 脳浮腫 / 脳低温療法 / 水チャンネル |
|---|
| 研究概要 |
本年度は、今後の研究の基礎とるアクアポリン(AQP)Knockdown細胞株の確立を重点に行った。
すでに論文発表があり、Western BlottingにてKnockdownが確認されているRNAiを生じさせる、DNA上の3箇所の塩基配列につき、shRNAをつくるよな64merのconstructを作成したうえ、vectorに導入した。shRNAを発現するvectorには、神経系の細胞のRNAiで定評のあるinvitrogen社製のBlock-IT Pol II miR RNAi expression vector、pcDNA 6.2-GW/miRを使用した。そのプラスミドを大腸菌にtransformationして、大量培養し、Quiagen社のキットを用いて、目的となるconstructを含むプラスミドを大量に、無菌的に精製した。さらに文献上のAQP4のRNAi用の3つのconstructに加え、申請者オリジナルのRNAi用のconstructを3つ、文献などによりRNAiを起こしやすい条件を参考に決定し、vectorに挿入した形で同様に大量に精製した。
アストロサイトにtrasnfectionする方法として、リポフェクションを利用した、タカラバイオ社製Trans-IT Neuralを使用した。ただ、現段階ではtransfectionの効率が非常に悪く、10%以下となっている。このことに関して、transfection効率の最もよくなると考えられる条件を、mediumの組成や、transfection reagentの量、vectorの量などの最適条件を検討中である。思ったような効率が得られない場合には、PC12 cellなどに用いて比較的高いtransfection効率を得ている、エレクトロポレーションなどの別のtransfectionの方法も検討する予定である。
Transfectionの効率など、これらの諸条件を最適なものとすることは、今後の実験の効率にとってcriticalのものであり慎重に検討する必要があると考えている。大方満足のいくRNAiを得ることができれば、実際の低温における脳浮腫効果の解明に用いていく予定である。
|
