| 研究課題/領域番号 |
18591801
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
佐々木 順造 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (30093686)
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| 研究分担者 |
三木 友香理 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 非常勤研究員 (70397876)
山田 輝夫 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (00033225)
小阪 淳 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 准教授 (40243216)
藤田 洋史 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教 (20423288)
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| キーワード | 解剖学 / 細胞・組織 / 精巣 / In situハイブリダイゼーション / 遺伝子 / mRNA / PERF15 / シグナル定量化 |
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| 研究概要 |
精巣は発育段階の同じ細胞が集団として存在し、同調した遺伝子発現を示すので、In situハイブリダイゼーション(ISH)法を用いたシグナルの定量化のために有用な臓器である。リボソーマルRNAの定量化のために行った、シグナル強度のボスタリゼーション(階調変更)による方法と蛍光シグナルによる方法を、精巣の連続切片での転写産物、PERF 15 mRNA、の定量に応用した。前者の方法ではシグナル強度を、白色(grade 1)から黒色(grade 5)までの5段階に分けた後、数値化し、後者の方法では0-255のmean pixel intensityで表した。両者の方法の間で、ほぼ同一の結果を得た。PERF 15 mRNA量は後期パキテン期およびディプロテン期の精母細胞で最大であり、初期精子細胞および中期パキテン期の精母細胞がこれに続き、生理的精子発生でアポトーシスが最も多く観察されるステージXIVの前後で高い値を示しており、減数分裂時に特定の機能を持つ可能性が明らかとなった。今回の定量法はISHシグナルの絶対量定量法の確立に大きな助けとなった。この方法の確立のために、スライドグラスのコーティング法、標準濃度の転写産物を塗布したスポット部に生成された反応産物の散逸を防ぐための処置などを検討し、また、標準濃度を含有するAGARブロックの切片のシグナル検出、培養細胞のシグナルを効率よく定量する方法が検討され、いずれも良好な結果が得られた。
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