子宮頸部発癌に関与する新規アポトーシス関連蛋白の探索とそれに基づく治療戦略開発

2006 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18591824
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 中川 俊介 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70270874)
• 研究分担者: 矢野 哲 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (90251264)
• キーワード: 新規癌抑制遺伝子 / 子宮頸部腺癌 / human Scribble / ヒトパピローマウイルス / E6癌蛋白 / ユビキチン化 / アポトーシス

研究概要

子宮頸がんの発症には約95%においてヒトパピローマウイルスの感染が関与するとされている。子宮頸部扁平上皮癌では、検出されるヒトパピローマウイルス(HPV)は16型がもっとも頻度が高いことが知られ、一方子宮頸部腺癌では検出されるHPVは18型がもっとも頻度が高いことが知られている。HPVはE6およびE7という二つの癌遺伝子をもち、E6,E7蛋白はそれぞれヒトの癌抑制蛋白p53,pRbと結合し、それらの癌抑制蛋白の機能を阻害することで癌化に寄与すると考えられる。high-risk E6蛋白はp53と結合する際にヒトの細胞蛋白であるE6APを必要とする。E6APはubiquitin-protein ligaseであり、E6蛋白はp53およびE6APと3量体を形成し、ターゲットとするp53に分解のマーカーとなるubiquitinを付加し、枝状にいくつものubiquitinを付加されたp53はプロテオソームで認識され、分解を受ける。私は大腸菌の中でGST fusion蛋白としてE6APを発現させ、baculovirusを用いてE6蛋白を発現し、GST pull-down法により、E6-E6AP複合体の結合蛋白の同定を試み、細胞極性の決定に関わる癌抑制蛋白としてhuman Scribble(hScrib)を同定した。細胞抽出液として、HPV陰性の細胞株を用いた。このGST fusion E6蛋白に選択的に結合する蛋白を銀染色をしたSDSゲルから切り出して、ペプチドマススペクトロメトリー(PMF)解析により解析した。本研究により、新規に同定されたE6の結合蛋白は乳癌において遺伝子の欠失が報告されているdeleted in breast cancer-1(DBC-1)であった。In vitroで発現させたDBC-1はE6の存在下では時間依存性に分解を受けた。DBC-1はアポトーシスの誘導により核移行シグナルを失い、ミトコンドリアに移行し、ミトコンドリアの凝集を来したことより、HPV陽性の子宮頸癌においては、DBC-1のアポトーシス過程における機能はE6による分解により阻害されており、遺伝子の欠失を認める乳癌同様に子宮頸癌の発癌過程に重要な働きをもつことが示された。さらにE6のユビキチン化により分解されるターゲットとして同定したhScribがcyclophosphamide等によるアポトーシスの誘導により、caspase依存性に分解を受けることを見いだした。In vitroで発現させたhScribはcaspase存在下に分解を受けた。またin vivoでhScribはUV照射等のDNA障害により分解を受け、その分解能はcaspase依存性であった。このことよりhScribは新規のdeath substrateであることが明らかとなり、蛋白のアミノ酸配列内でcaspase存在下に分解を受けるかを検討している。hScribは16のleucine-rich repeatsと4のPDZ domainをもつ。In vitroで発現させた。hScribはleucine-rich repeatsとPDZ domainの間でcaspaseにより分解を受けた。以上の実験結果をもとにcaspaseがhScribのどの部位を分解するかを探索し、分解のターゲットとなるアスパラギン酸のアミノ酸を同定することを試みている。caspaseにより分解を受けない変異体のhScribが同定されれば、その変異体がin vivoでもcaspaseにより分解されないことを確認し、それを細胞内にトランスフェクションし、アポトーシスが阻害されるかを検討していく。

研究成果

• [雑誌論文] Combined phospho-Akt and PTEN expressions associated with post-treatment hysterectomy after conservative progestin therapy in complex atypical hyperplasia and stage Ia, G1 adenocarcinoma of the endometrium (2007)
  • 著者名/発表者名: Minaguchi T, Nakagawa S, Takazawa Y, Nei T, Horie K, Fujiwara T, Osuga Y, Yasugi T, Kugu K, Yano T, Yoshikawa H, Taketani Y.
  • 雑誌名: Cancer Lett. 248(1) ページ: 112-122
• [雑誌論文] Human Scribble, a novel tumor suppressor identified as a target of high-risk HPV E6 for ubiquitin-mediated degradation, interacts with adenomatous polyposis coli (2006)
  • 著者名/発表者名: Takizawa S, Nagasaka K, Nakagawa S, Yano T, Matsumoto Y, Nakagawa K, Minaguchi T, Oda K, Hiraike-Wada O, Ooishi H, Matsumoto K, Yasugi T, Taketani Y
  • 雑誌名: Genes to Cells. 2006 11 ページ: 453-464
• [雑誌論文] Involvement of a cellular ubiquitin-protein ligase E6AP in the ubiquitin-mediated degradation of extensive substrates of high-risk human papillomavirus E6. (2006)
  • 著者名/発表者名: Matsumoto Y, Nakagawa S, Yano T, Takizawa S, Nagasaka K, Nakagawa K, Minaguchi T, Wada O, Ooishi H, Matsuiuoto K, Yasugi T, Kanda T, Huibregtse JM, Taketani Y.
  • 雑誌名: J Med Virol. 78(4) ページ: 501-507
• [雑誌論文] Human scribble, a novel tumor suppressor identified as a target of high-risk HPV E6 for ubiquitin-mediated degradation, interacts with adenomatous polyposis coli (2006)
  • 著者名/発表者名: Takizawa S, Nagasaka K, Nakagawa S, Yano T, Nakagawa K, Yasugi T, Takeuchi T, Kanda T, Huibregtse JM, Akiyama T, Taketani Y.
  • 雑誌名: Genes to Cells 11(4) ページ: 453-464
• [雑誌論文] Human homolog of Drosophila tumor suppressor Scribble negatively regulates cell-cycle progression from G1 to S phase by localizing at the basolateral membrane in epithelial cells (2006)
  • 著者名/発表者名: Nagasaka K, Nakagawa S, Yano T, Takizawa S, Matsumoto Y, Tsuruga T, Nakagawa K, Minaguchi T, Oda K, Hiraike-Wada O, Ooishi H, Yasugi T, Taketani Y.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 97(11) ページ: 1217-1225
• [雑誌論文] Analysis of the expression and localisation of a LAP protein, human scribble, in the normal and neoplastic epithelium of uterine cervix.
  • 著者名/発表者名: Nakagawa S., Yano T, Nakagawa K, Takizawa S, Suzuki Y, Yasugi T, Huibregtse JM, Taketani Y.
  • 雑誌名: Br J Cancer. ページ: 90(1):194-90(1):199
• [雑誌論文] The DNA mismatch repair gene hMSH2 is a potent coactivator of oestrogen receptor alpha
  • 著者名/発表者名: Wada-Hiraike O, Yano T, Nei T, Matsumoto Y, Nagasaka K, Takizawa S, Oishi H, Arimoto T, Nakagawa S, Yasugi T, Kato S, Taketani Y.
  • 雑誌名: Br J Cancer. 2005 ページ: 2286-2291
• [雑誌論文] Comparison between conventional surgery and radiotherapy for FIGO stage I-II cervical carcinoma : a retrospective Japanese study
  • 著者名/発表者名: Yamashita H, Nakagawa K, Tago M, Shiraishi K, Nakamura N, Ohtomo K, Oda K, Nakagawa S., Yasugi T, Taketani Y.
  • 雑誌名: Gynecol Oncol. ページ: 834-839