| 研究概要 |
試料は敗血症患者の末梢血単核球(PBMC)。平成18年度はPBMCの細胞質I-κBおよび核内NF-κBの測定を行った。準備として密度勾配遠心で分離したPBMC層をRPMI1640で培養し1x106個/mlとした。ついで10nM HEPES入りの低張液で細胞を融解したのち高速遠心(Beckman遠心器:100,000xg)し、I-κBおよびNF-κBの定量およびDNAの発現量を測定。
1.タンパク質の精製
密度勾配遠心で分離した患者PBMC層に10倍量の0.32M sucrose加えた後、Polytron PT-10型ホモジナイザー及びPotter型ホモジナイザーを利用して、ホモジネートを行った。ホモジネートした組織はBeckman遠心器を利用して100,000g x 60分でP2分画に精製分離し、Bradford法でタンパク定量。
2.I-κBとNF-κBのDNAの発現量
精製したP2分画に32P-ATPでラベルしたコンセンサスモチーフを有するプローベ(Promega社製Kit)を結合させた後5%アクリルアミドゲル上で30mA、1時間電気泳動(EMSA)を行い、Whatman 3M紙に転写してautoradiograhpy(アロカ社製)で定量した。
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