| 研究課題/領域番号 |
18592099
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 昭和大学 |
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研究代表者 |
山田 嘉重 昭和大学, 歯学部, 講師 (40360127)
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| 研究分担者 |
中村 幸生 昭和大学, 歯学部, 助教授 (40207931)
木村 裕一 昭和大学, 歯学部, 助教授 (60211877)
増田 宜子 昭和大学, 歯学部, 講師 (10297038)
川中 岳雄 昭和大学, 歯学部, 助手 (10365702)
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| キーワード | アメロジェニン / エクソン / In situ PCR法 / ラット上顎切歯 / 組織学的観察 / LAMP法 / 歯胚 |
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| 研究概要 |
アメロジェニンの7つのエクソンそれぞれのプライマーを作成した。作成したプライマーのセットは(a)エクソン1-7(b)エクソン1-3(c)エクソン4-7(d)エクソン5-7(e)エクソン6-7である。当初はエクソン7のみも検討していたが、エクソン7のみの遺伝子配列は短くプライマー設計が困難なため、今回は上記a)〜e)を作成した。作成したプライマーにて遺伝子の増幅が行えるかを確認するため、現在所有しているマウスアメロジェニンcDNAを使用してPCRを行った。当初はb),d),e)において満足いく増幅が得られなかったため、プライマーの設計を何度がし直し、その結果、最終的に全てのグループにおいてPCRでアメロジェニンの遺伝子増幅が行えるプライマーを得ることができた。
次にラット上顎切歯の組織切片に対して、それらプライマーを用いてIn situ PCR法を行った。エクソン4、5を含んだプライマーセットc),d)において歯胚の初期に遺伝子反応を確認した。しかし、PCR操作に伴う加温、冷却の繰り返しによる組織切片の損傷が著しく、明瞭な反応を断定することが困難であった。またPCR In situ hybridization法の採用も考えたが、組織切片の著しい破損という同様の問題があるため、新たな方法に切り替えた。
近年、四種のプライマーを利用した遺伝子増幅法(LAMP法)が提唱されてきている。同方法は、PCR法に比べて遺伝子の増幅率が高いうえに、65度前後の一定温度で加温するだけであり、PCR法での加温と冷却の繰り返しの問題が無く、我々の研究もLAMP法を応用して組織学的に観察することを検討した。現在は新たに、LAMP法用にアメロジェニンのプライマーを設計している。
今はまだ、全てのプライマーが遺伝子増幅に成功できておらず、今は全てのプライマーセットにてLAMP法で増幅ができるように準備をしている。
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