| 研究概要 |
本研究課題では、in vivo部位特異的組換え技術を用いて固定されたゲノム位置に任意のトランスジーンを挿入することができる「リサイクルトランスジェニック」系統の作成を目的とする。これにより、ゲノム挿入位置に依存したプロモーター特性を排除したより正確なプロモーター領域の持つ組織・細胞特異性を明らかにすることが可能になる。平成18年度において、まずプロモーター領域3',5'両端にloxP配列を含み、下流にEGFP蛍光蛋白質を発現する発現ベクターをloxP配列をoligo DNAで合成して付加する方法を用いて作製した。用いるプロモーターとしては、神経系で発現するものとしてGAP43 promoterを検討したが、上流1kbではやや発現が弱かったために、新たに2kbのものをPCRにより取得し、ベクター構築を行った。メダカ受精卵へのインジェクションの前に、in vitroで組換え反応が起こる事を確認するために、リコンビナントCreによりloxP配列のexcisionアッセイを行い、正しく組換えが起こることを確認した。次に、プロモーターとレポーターの間にloxP配列が挿入されるため、発現パターンが変化あるいは抑制される可能性があったが、それを検証するためにメダカ受精卵(STll)系統にこの発現ベクターを微量注入し、GOにおける発現パターンを確認した。このときコントロールとして、loxPを含まない配列を用いた。pGAP43-2kプロモーターはほとんどの神経細胞で3日目胚から中枢神経系で発現が認められ、その発現は孵化後まで続いた。loxPを含むものも、同様の発現パターンを示したため、挿入されているloxP配列はプロモーター特性に影響が無いことが分かった。現在、多数インジェクションしたGOメダカを生育しており、今後F1の解析を行う予定である。本年度の研究成果の一部として学会発表2件を行った。
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