|
既存タンパク質の部分配列を混ぜ合わせたキメラタンパク質ライブラリーの作製は、相同性の高いファミリー酵素間で行われてきた。相同性の低いファミリータンパク質(酵素)同士からでも、効率的にキメラ酵素を作り出すための手法を開発することを目的として研究を行っている。FAD依存のオキシドリダクターゼファミリーの中で、ベンゼン環を持つ化合物への水酸基導入に関与した性質の異なる2種類の酵素(相同性30%以下)をモデル酵素として用いた。
1.異なるベクター上にクローン化した2種類のオキシドリダクターゼファミリー遺伝子(M.loti MAFF303099 ubiHとP.putida PpG7 nahG)の間で、我々が開発したin vivoシャフリングを利用して相同組換えを行った。相同性の高いbphC間でのin vivoシャフリングと違ってキメラ遺伝子の形成効率が著しく低いことが明らかとなった。また、得られたキメラ遺伝子の塩基配列を調べたところ、いずれかの親酵素遺伝子と同じ配列を持つものが大部分であった。この原因については不明であるが、従来行ってきたtwo-way ligationの代わりにthree-way ligationによって直鎖上DNAの作成を行った。しかしながら、キメラ遺伝子の割合を上昇させることはできなかった。
2.得られたキメラ遺伝子を活性測定のための大腸菌HMS174に導入し、酵素活性を親酵素であるMHPC、 salicylate hydroxylaseの基質である5-ヒドロキシニコチン酸、サリチル酸を用いて測定した。キメラ酵素の評価系として、プレートリーダーと96穴マイクロタイタープレートを利用したハイスループット系を開発した。細胞抽出液に5-ヒドロキシニコチン酸、サリチル酸のそれぞれを加え、NADHの減少で測定したMHPC、salicylate hydroxylase活性の割合を指標にキメラ酵素を評価した。いずれも活性が検出されないか親酵素に比べて著しく低いものであった。
|
