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本年度はHERC2全長cDNAのクローニングを目指して実験を進めた。データベースに登録されているHERC2遺伝子の塩基配列を元に制限酵素マップを作成し、全長cDNAを構築する際に利用できる制限酵素配列を決定した。HERC2を発現しているマウス脳よりmRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、マウスHERC2の全長(約15kb)をカバーする1kbから3kbのHERC2断片のcDNAをPCRで増幅しpcDNA3ベクターにクローニングした。シークエンスを読んでcDNAの塩基配列に変異が無いことを確認した。
今後、この断片をつなぎ合わせて全長15kbのcDNAの発現ベクターを作成する予定であるが、プラスミドベクターのサイズが長いと形質転換効率が著しく低下し、目的のクローンをとるのが非常に難しくなる。そこでHERC2cDNAの3'側下流に逆向きにEM7プロモーターでドライブするZeocin耐性遺伝子をつなぎ大腸苗での選択に利用できるかどうか検討した。その結果、Amp耐性のコロニーをさらにZeocinプレートに播種し、Amp耐性かつZeo耐性のコロニーを選択することにより、効率よく目的のクローンを得られることがわかった。
従って最終段階のligationでは、HERC2のN末半分の発現ベクターに、Zeo耐性遺伝子を持ちHERC2のC末半分をコードする領域をつなぎ、Amp耐性かつZeo耐性のコロニーを選択することにより、効率よく全長のHERC2遺伝子をクローニングすることができると期待される。
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