| 研究概要 |
ATBF1が実際に細胞質/核を移動している細胞系の準備:マウス由来胚性がん細胞株P19細胞のレチノイン酸による神経分化誘導系が極めて鋭敏かつ再現性よくATBF1の細胞質/核の移動を観察できる。NES/NLSごとのGFP蛍光タンパク質タグ付き融合発現vectorを完成させ、P19細胞に遺伝子導入を試みたが、導入効率が極めて低いために、COS-7細胞株に変更して、細胞内局在シグナル活性を確定する実験を実施した。アミノ酸の一次構造的から予想していた4カ所の核移行シグナルのうちそれぞれ独自に核移行シグナル活性があることをみいだした。それぞれATBF1のアミノ酸配列の開始番号で分類される4カ所のNLSコンセンサス配列(277、1387、2947、2987)で分類してそれぞれの機能解析を行った。その結果、277には有意な核移行活性は認められなかった。他の1387、2947、2987には2倍から7倍程度の核へのタンパク質発現の集中が認められた。2947と2987は実際のタンパク質上では隣接して存在する。そこでGFP蛍光タンパク質タグ付き融合発現vectorにもこの2カ所をタンデムにつなげた発現系を作成して検定したところ、核への集積が32と非常に強い核移行シグナルとして機能することを証明することができた。(三浦、川口)ATBF1がATMによってリン酸化される機能ドメインの決定:私たちの研究とは独立してハーバード大学の研究グループの網羅的検索によりATBF1がATMによってリン酸化される候補アミノ酸の一つが決定された(Science316,1160、2007)。このリン酸化は、ATMからATBF1へのシグナル伝達系として極めて重要は意味があるとかんがえられ、Ser1180がその標的アミノ酸であることが決定された。その検定を容易に実施できる系を確立する必要があり、抗リン酸化Ser1180モノクローナル抗体の作成を開始した。ペプチド合成、免疫、ハイブリドーマ細胞との融合、非リン酸化ペプチドとリン酸化ペプチドへの反応性に差があるクローンの選択まで研究を進めることができた。(三浦)
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