| 研究課題/領域番号 |
18659300
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
内山 聖 新潟大学, 医歯学系, 教授 (80108050)
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| 研究分担者 |
里方 一郎 新潟大学, 医歯学系, 教授 (70170800)
伊東 達雄 新潟大学, 医歯学系, 助手 (40345533)
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| キーワード | ES細胞 / 腎前駆細胞 / WT1遺伝子 / Sall1遺伝子 |
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| 研究概要 |
1.ES細胞の遺伝子改変
マウスES細胞から分化した腎前駆細胞を生きたまま選び出す目的で、living colorである緑色蛍光遺伝子EGFPと赤色蛍光遺伝子DsRedが、ES細胞が腎前駆細胞に分化した時に活性化されて緑色と赤色の両方の蛍光を発するように、ES細胞のWT-1遺伝子座に緑色蛍光遺伝子EGFPを、Sall-1遺伝子座に赤色蛍光遺伝子DsRedをそれぞれノックインした。すなわち、WT-1 targeting vectorをES細胞にelectroporationにより導入し、G418とdiphtheria toxin A (DTA)によるpositive-negative selectionにより、相同組換え体(WT-1遺伝子座がEGFPによりノックインされたES細胞)を得た。さらに、得られた相同組換え体にSall-1 targeting vectorを導入し、高濃度G418とDTAによるdouble selectionにより、最終的に、WT-1遺伝子座に緑色蛍光遺伝子EGFPが、Sall-1遺伝子座に赤色蛍光遺伝子DsRedがそれぞれノックインされたES細胞を樹立した。さらに、移植後の組織学的解析においてES細胞由来の細胞をX-gal染色により他の細胞と識別する目的で、LacZ遺伝子を導入した。
2.ES細胞から腎前駆細胞への分化誘導法の開発
ノックインしたES細胞をレチノイン酸添加培地により培養して胚様体を作成した。胚様体をマウス腎皮膜下に移植したところ、ごく少数の細胞がEGFPとDsRedの両方の発現を示した。しかしながら、頻度が低すぎたので、胚様体の細胞をコラゲナーゼを用いて単離し、胎生13.5日から胎生16.5日までの後腎あるいは腎組織とコラーゲンゲルによる3次元共培養を数日行ったところ、EGFPとDsRedの両方の発現を示す細胞の頻度が高まった。今後、この3次元共培養組織をマウス腎皮膜下に移植して、腎組織に分化するか否か検討を行う。また、EGEPとDsRedの両方の発現を示す細胞をCell sortingにより分取し、マウス腎皮膜下あるいは腎実質に移植して、腎組織に分化するか否か検討を行う予定である。
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