レンチウイルスベクターとsh・RNAを用いたノックダウンマウスの作製

2007 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18659325
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 橋本 公二 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (00110784)
• 研究分担者: 花川 靖 愛媛大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (90284398)
• キーワード: Toll-like receptor / sh-RNA / レンチウィルスベクター / ノックダウン / トランスジェニックマウス / TLR2 / TLR3 / 角化細胞

研究概要

本研究の目的は、sh-RNA法とレンチウイルスベクターの技術を融合したノックダウンマウスの作製法を樹立することである。この技術が確立されれば低コストで短時間に多くの遺伝子の機能が抑制されたマウスを作製することが可能となり、皮膚科領域のみならず、生物、医学研究の発展に大きな貢献ができるのではないかと考えられる。具体的には、プロトタイプモデルとしてToll-like recptor(TLR)アイソタイプを同時に抑制するトランスジェニックマウスを作成する。TLR2,TLR3の発現を効果的に抑制できるsh-RNAを作製し、レンチウィルスベクターに組み込んだ。このウィルスベクターを角化細胞に導入し、抑制効果を確認した。生後1日の新生児マウス背部皮膚を剥離切除しディスパーゼ処理、続いてトリプシン処理を行い、低カルシウム無血清培地をもちいて表皮細胞を培養した。レンチウイルスベクターをMOI20にて感染し48h後にtotal RNAを回収した。標的配列を持つウイルスの効果をコントロールスクランブル配列と比較してABI prismを用いてreal-time PCRを行った。TLR2,TLR3のリガンド刺激においてシグナル伝達は抑制されていた。レンチウイルスベクターのpLe-U6iのU6 promoterとsh-RNA配列の間にバクテリオファージ由来のloxP配列、終止配列(TTTTTT)、loxP配列をタンデムにつないだスタッファーを挿入しsilent-lentivirus vector(U6LSL-shRNA,LSL=loxP-stop-loxP)を作製した。このベクターを用いてトランスジェニックマウスを作製する準備までは完了したが、実際のマウス作製には至らなかった。

研究成果

• [雑誌論文] An intermediary role of proHB-EGF shedding in growth factor-induced c-Myc gene expression (2008)
  • 著者名/発表者名: Nanba D, Inoue H, Shigemi Y, Shirakata Y, Hashimoto K, Higashiyama S
  • 雑誌名: J Cell Physiol 214 ページ: 465-73
  • 査読あり
• [雑誌論文] PPARgamma is an important transcription factor in lalpha, 25-dihydroxyvitamin D3-induced in volucrin expression (2008)
  • 著者名/発表者名: Dai X, Sayama K, Shirakata Y, Tokumaru S, Yang L, Tohyama M, Hirakawa S, Hanakawa Y, Hashimoto K
  • 雑誌名: J Dermatol Sci 50 ページ: 53-60
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human corneal epithelial cell proliferation by epiregulin and its cross-induction by other EGF family members (2007)
  • 著者名/発表者名: Morita S, Shirakata Y, Shiraishi A, I Kadota Y, Hashimoto K, Higashiyama S, Ohashi Y
  • 雑誌名: Molecular Vision 13 ページ: 2119-2128
  • 査読あり
• [雑誌論文] Epiregulin, a member of the EGF family, is over-expressed in psoriatic epidermis (2007)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y, Kishimoto J, Tokumaru S, Yamasaki K, Hanakawa Y, Tohyama M, Sayama K, Hashimoto K
  • 雑誌名: J Dermatol Sci 45 ページ: 69-72
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hair follicle regeneration using grafted rodent and human cells (2007)
  • 著者名/発表者名: Ehama R, Ishimatsu-Tsuji Y, Iriyama S, Ideta R, Soma T, Yano K, Kawasaki C, Suzuki S, Shirakata Y, Hashimoto K, Kishimoto J
  • 雑誌名: J Invest Dermatol 127 ページ: 2106-15
  • 査読あり
• [雑誌論文] STAT5a/PPARgamma Pathway Regulates Involucrin Expression in Keratinocyte Differentiation (2007)
  • 著者名/発表者名: Dai X, Sayama K, Shirakata Y, Hanakawa Y, Yamasaki K, Tokumaru S, Yang L, Wang X, Hirakawa S, Tohyama M, Yamauchi T, Takashi K, Kagechika H, Hashimoto K
  • 雑誌名: J Invest Dermatol 127 ページ: 1728-35
  • 査読あり
• [雑誌論文] Suppressor of cytokine signaling 3 negative regulation of signal transducer and activator of transcription 3 in platelet-derived growth factor-induced fibroblast migration (2007)
  • 著者名/発表者名: Nagai H, Tokumaru S, Sayama K, Shirakata Y, Hanakawa Y, Hirakawa S, Dai X, Tohyama M, Yang L, Hashimoto K
  • 雑誌名: J Dermatol 34 ページ: 523-530
  • 査読あり
• [雑誌論文] CXCL16 is a novel mediator of the innate immunity of epidermal keratinocytes (2007)
  • 著者名/発表者名: Tohyma M, Sayama K, Komatsuzawa H, Hanakawa Y, Shirakata Y, Dai X, Yang L, Tokumaru S, Nagai H, Hirakawa S, Sugai M, Hashimoto K
  • 雑誌名: Int Immunol 19 ページ: 1095-1102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Association of human herpesvirus 6 reactivation with the flaring and severity of drug-induced hypersensitivity syndrome (2007)
  • 著者名/発表者名: Tohyama M, Hashimoto K, Yasukawa M, Kimura H, Horikawa T, Nakajima K, Urano Y, Matsumoto K, Iijima M, Shear NH
  • 雑誌名: Br J Dermatol 157 ページ: 934-40
  • 査読あり
• [学会発表] A new skin equivalent using de-epithelialized amnion membrane (2007)
  • 著者名/発表者名: Shirakata Y, Yang L, Hashimoto K
  • 学会等名: 8^<th> Congress of the German-Japanese Society of Dermatology
  • 発表場所: Yokohama
  • 年月日: 20071115-17
• [学会発表] Milroy's disease:a case report of the congenital lymphedema pedigree (2007)
  • 著者名/発表者名: Hirakawa S, Murakaami S, Hashimoto K
  • 学会等名: The 15^<th> Korea-Japan Joint Meeting of Dermatology
  • 発表場所: Jeju
  • 年月日: 20070602-03
• [学会発表] PRAR-gamma is involved in 1.25-dihydroxyvitamin D3-induced beta-defensin-3 and cathelicidin expression in normal keratinocyte (2007)
  • 著者名/発表者名: Dai X, Shirakata Y, Sayama K, Tokumaru S, Hirakawa S, Tohyama M, Yang L, Hashimoto K
  • 学会等名: 68^<th> Annual Meeting of the Society for Investigative Dermatology
  • 発表場所: Los Angeles
  • 年月日: 20070509-12
• [学会発表] Development of a new skin equivalent model using de-epithelialized amnion membrane (2007)
  • 著者名/発表者名: Yang L, Shirakata Y, Dai X, Tokumaru S, Hirakawa S, Sayama K, Hashimoto K
  • 学会等名: 68^<th> Annual Meeting of the Society for Investigative Dermatology
  • 発表場所: Los Angeles
  • 年月日: 20070509-12
• [学会発表] Ablation of TAKl in mouse keratinocytes disturbed hair follicle development (2007)
  • 著者名/発表者名: Sayama K, Kajiya K, Shirakata Y, Hanakawa Y, Hirakawa S, Dai X, Nagai H, Akira S, Kishimoto J, Hashimoto K
  • 学会等名: 68^<th> Annual Meeting of the Society for Investigative Dermatology
  • 発表場所: Los Angeles
  • 年月日: 20070509-12
• [学会発表] Targeted overexpression of VEGF-A of -C in the skin promotes lymph node lymphangiogenesis and metastasis (2007)
  • 著者名/発表者名: Hirakawa S, Kodama S, Brown LF, Paavonen K, Hashimoto K, Alitalo K, Detmar M
  • 学会等名: 2^<nd> Intemational symposium on cancer metastasis and the lymphovascular system
  • 発表場所: Sanfrancisco
  • 年月日: 20070502-05