| 研究課題/領域番号 |
18659436
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
川口 浩 東京大学, 医学部附属病院, 助教授 (40282660)
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| 研究分担者 |
中山 修一 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (80401066)
原 慶宏 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (00422296)
村上 元昭 東京大学, 医学部附属病院, 医員 (50396751)
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| キーワード | klotho / プロモータ / 老化 |
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| 研究概要 |
初年度の今年は、klothoプロモーターの転写制御アッセイシステムを確立した。
1)ルシフェラーゼアッセイシステムの構築
まずヒトgenomic cDNAを用いたPCRにより約1.4kbのKlothoプロモーター領域を得た。これをルシフェラーゼレポーターベクターに組み込んだものをもとにしてプロモーターの5'側を段階的に欠失させたレポーターベクターを作成した。
2)コアエンハンサー領域の同定
1)で作成したプロモーターの活性を調べた結果、欠失させた領域が大きいほど転写活性は強くなり、作成した中で最も短い転写開始点から上流124bpのklothoプロモーターの転写活性が最も強かった。したがってklothoプロモーター内転写調節領域は転写開始点近傍に集中していると推測された。次いでヒトとマウスの転写開始点近傍の配列を比較し、2つの種間高度保存領域(-98bp〜-68bp、-53bpから〜15bp)を発見した。これらをA-box、B-boxと命名しそれぞれのタンデムコンストラクトを用いたルシフェラーゼアッセイを行ったところ、A-boxはそのコピー数に応じて転写活性の上昇を示したが、B-boxのタンデムコンストラクトでは活性の上昇は見られなかった。しかしA-boxのタンデムコンストラクトにB-boxをつないだ合成プロモーターはさらに転写活性の上昇を示したことからB-boxも転写調節領域として重要であると考えられる。このA-boxおよびB-boxをklotho遺伝子のプロモーター内コアエンハンサーとして同定たした。これを用いてさらに今後のアッセイを進めていく予定である。
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