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1)発現クロー二ング、サウズウエスタンスクリーニングによるklotho上流分子の探索 昨年までのルシフェラーゼアッセイを用いた検討で、klotho遺伝子プロモーター応答領域は転写開始点から-98bp〜-68bpおよび-53bpから〜15bpに存在することを突き止めた。本年度は、培養液中の血清に有無によって両シスエレメントに結合する分子め存在をgel-shift assayで確認した。その結果、-98bp〜-68bpへの特異的な結合がprobe mutagenesis、非標識probeによる競合阻害によって証明された。一方、-53bpから〜15bpの領域は発現のベースラインの維持に必要と推測された。更にinvivoでの結合もクロマチン免疫沈降法(ChlP)で確認された。しかしながら、両領域には既知の転写因子結合モチーフは存在せず、転写因子の特定に至ることは出来なかった。
2)リン、Vit.Dによるklotho転写制御の検討 リンおよびVit.Dの投与によってklotho mRNA量が増加することをreal-time PCRで確認した。上記で同定したklothoプロモータコンストラクトを用いて、リン、Vit.Dの応答エレメントの同定を試みたが、結合部位および下流分子の同定にはいたらなかった。また、gel-shift assayおよびChlPによっても、リン、Vit.Dによって結合の増加する分子を特定することは出来なかった。
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