| 研究課題/領域番号 |
18659587
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
平野 博之 東北大学, 大学院・歯学研究科, 大学院非常勤講師 (50400388)
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| 研究分担者 |
高橋 雅彦 東北大学, 大学院・歯学研究科, 教授 (60236320)
城戸 幹太 東北大学, 病院, 助教 (40343032)
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| キーワード | 遺伝子導入 / マイクロバプル / 非ウィルスベクター / 超音波エコー / 脊髄 / β-endorphin |
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| 研究概要 |
本年度は前年度に得られた脊髄への遺伝子導入の手技をもとに、実際に鎮痛遺伝子とレボーター遺伝子を持つプラスミドを作成し、in vivoで実際の疼痛に対する治療効果があるかどうかを検討した。
1.鎮痛遺伝子であるβ-endorphinの前駆体、proopiomelanocortinの抽出
マウス(C3H)全脳より逆転写反応にてcDNAを合成、設計したプライマーにてPCR反応を行い標的遺伝子(POMC)を増幅・回収。
2.プラスミドの作成
得られた遺伝子を業者に外注しレポーター遺伝子であるGFPを持つプラスミドベクターヘクローニング(pTracer-CMV Bsd, invitrogen)。
3.タンパク発想の確認
作成したプラスミドが標的タンパクを発現するかどうかinvitroで確認した。293T細胞に超音波エコーを用いて遺伝子導入した結果、コントロール(GFPのみ)と比較するとGFP発現自体かなり少量であった(100:5個)。種々条件を変更し、最も発現量の多いと思われる条件にてマウスへの導入を行った。
4.マウスへの遺伝子導入およびタンパク発現・機能の確認
前年度に確立した手技により脊髄に遺伝子を導入した。GFPタンパクの発現を病理組織切片を作成し蛍光顕微鏡にて経時的に観察したが、コントロールに比して明らかに発現量が少なく、定量化できなかった。しかし、機能的に鎮痛効果が発現している可能性も考え、ホットプレート試験にて観察したが、コントロール群と比べて有意差は見られなかった。
以上より、今後プラスミドDNAの形状を詳細に検討し、改良を加え、さらなる導入効率の向上をin vitroにて確認の後、再度動物実験にて鎮痛効果の確認を行いたい。現在も進行中である。
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