| 研究分担者 |
上松 隆司 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 助教授 (40203476)
松浦 隆 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (10298408)
堂東 亮輔 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (40329470)
内橋 隆行 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (70397628)
楢本 浩子 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (30410426)
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| 研究概要 |
ヘリカーゼは,mRNAの巻き戻し(unwinding)を行う細胞増殖に必要な酵素である.特に癌細胞では,蛋白合成や浸潤,転移に影響を与えると考えられる.癌細胞のRNAの巻き戻し作用とその後に生じる蛋白合成を抑制する阻害剤を開発すれば,新しい癌治療法が開発される.本年度は,頭頸部癌細胞由来のRNAヘリカーゼのDNA断片の単離と抗体の作製を行った.
頭頸部癌細胞(SCCTM, HSG)を無血清培養し,細胞抽出液および培養上清を回収した.培養上清は,セントリコンプラス20(ミリポア社)で濃縮しサンプルとした.このサンプルからゲル濾過カラム,イオン交換クロマトグラフィー,レクチンカラム,アフィニティカラムを用いて分離した後FPLCで最終分画を得た.精製蛋白は,フロイントアジュバントを用いてSPFウサギに免疫し,ヒトRNAヘリカーゼ活性に対する抗血清を得た.抗体の有用性は,抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認した.RNAヘリカーゼ活性の高い頭頸部癌培養細胞からAGPC法でtotal RNAを抽出し,オリゴdTカラムでmRNAを抽出した.微量核酸測定用分光光度計で260nm/280nmでmRNAを定量後,純度を確認しcDNAを合成した.本研究のvalidationのため,クローニング操作では,HeLaのUNIZAPIIファージベクターにスブクローニング後,in vivo excisionによりファージミドライブラリーを作製し,イムノブロット操作では,唾液腺由来細胞を用いてATP binding cassette transporterの発現を検討した.今後は,これら分子生物学的手法を用いてヘリカーゼ活性を示す蛋白をクローニングする予定である.
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