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本研究課題では、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索ガイダンスの分子機構を、交連ニューロンのサブタイプレベルでの運命決定(特異的な転写調節因子による神経細胞の個性発現)という観点から迫ることで、サブタイプ特異的な軸索ガイダンスプログラムの同定を目指している。昨年度までの研究において、マウス胎仔の脊髄から中脳における交連ニューロンの軸索伸長パターンを詳細に把握し、それらの交連ニューロン(サブタイプ)における転写調節因子群の発現パターンを解析し、交連ニューロンのサブタイプの個性決定に関わっている可能性がある候補分子をリストアップした。本年度は、候補分子の中でも転写調節因子Otx2に着目し、Otx2が交連ニューロンのサブタイプ固有の軸索投射パターン形成に関わっているかどうかを検討した。そのために、Otx2と軸索の挙動をモニターするための蛍光レポータータンパク質が共発現するように設計されたIRESバイシストロン性発現ベクターを構築した。この発現ベクターを、本来Otx2を発現しない交連ニューロンのサブタイプに遺伝子導入し、サブタイプ特異的な軸索伸長パターンが形成されるかどうかを調べた。また、この遺伝子導入技術は昨年度までの研究成果として既に確立させているマウス胎仔へのin vivoエレクトロポレーション法に従い行った。遺伝子導入後の交連ニューロンの軸索の挙動は、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて解析した。その結果、Otx2の異所的な発現ならびにその単独の作用では、サブタイプ特異的な軸索伸長パターンが引き起こされないことが示唆された。転写調節因子による個性決定過程では複数の特異的な転写調節因子の組み合わせ(共同作用)が個性決定に貢献していることが知られていることから、現在さらに、複数の候補分子の組み合わせ発現をも考慮した遺伝子導入の実験を行い、交連ニューロンのサブタイプ特異的な軸索伸長パターン形成への寄与を検討している。
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