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分子モーターキネシンの構造変化を一分子レベルで検出するために、一分子蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)法を用いた分子内距離変化の測定を行った。本年度は、微小管上を運動中のキネシンダイマーが両足を交互に動かしている様子を直接観察するために、2つの頭部に一つずつ結合させた色素間の距離を一分子FRET法で測定した。片方の頭部の前方ともう一方の頭部の後方にシステイン残基を導入し、この部位を蛍光色素で標識した。AMPPNP(加水分解されないATPアナログ)存在下では、両足結合状態に相当するFRET効率が観察され、低濃度のADP存在下では、片足結合状態に相当するFRET効率が観察された。ATP存在下で微小管上を運動中のキネシンのFRET効率を測定したところ、高ATP濃度では両足結合状態を主に取ること、また低ATP濃度条件下では片足結合状態を長く取ることが明らかになった。この結果は、ATP結合を待っている状態では片足のみで微小管に結合した構造をとることを示すものである。片足結合構造の維持はATPの選択的な結合を可能にし、それゆえATPの加水分解が2つの頭部で交互に起きることを保証していると考えられる。次に、運動中のキネシンに負荷をかけるためのアプローチとして、2分子のキネシンを架橋し、片方のキネシンをアンカーとしてもう一方のキネシンに負荷をかける実験系の開発を行った。野生型キネシン2分子にそれぞれ異なる蛍光色素をつけて2つの蛍光を同時に観察することにより、2分子の架橋がある程度の割合で成功していることを確認した。
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