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分子モータータンパク質キネシンの研究は一分子計測法の進展と共に急速に進んできたが、依然として力が発生する仕組みの理解にまでは至っていない。本研究では、キネシンによる力発生の構造基盤を明らかにすることを目的として、まずキネシンに負荷をかけた状態で構造変化を検出する方法の確立を行い、さらにその方法を用いて負荷存在下で運動中のキネシンの構造変化の観察を行うことにした。本年度はまず、昨年度確立した光ピンセットを使わずにキネシンに負荷をかける実験系において、実際に負荷がかかっていることを確認した。具体的には、キネシン2量体の尾部に微小管に結合した後解離することのできない変異体キネシン頭部を融合したコンストラクトを用いた。尾部と変異体キネシンとの間にランダムコイルペプチドを挿入し、その前後にFRET用のドナーとアクセプターの蛍光色素を導入した。ATP非存在下と比べてATP存在下ではFRET効率の低下が見られた。これはキネシンに十分な負荷がかかってランダムコイルが伸びていることを示すものである。次に、野生型キネシンの2つの頭部にそれぞれドナーとアクセプターの蛍光色素を導入し、FRET効率を一分子レベルで観察することにより、キネシンが両足結合状態と片足結合状態を交互に遷移しながら運動する様子を観察した。その結果、飽和ATP存在下で負荷を受けて運動しているときには無負荷の場合と比較して、片足結合状態を取る時間が大幅に長くなることが分かった。この結果は、片足結合状態から両足結合状態への遷移が最も負荷の影響を受けること、また浮いた頭部の拡散による前方への移動が負荷により抑えられることがその構造基盤であることを示すものである。
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