研究課題
本研究の目的はNa^+により活性調節を受けた骨格筋特異的カルパインp94の骨格筋細胞内部での生理学的な意義を明らかにすることである。昨年度は(1)初代骨格筋細胞におけるp94のNa^+による活性化について、および(2)p94の基質となる標的分子の探索および同定に関して重点的に研究を行った。(1)に関してはマウス骨格筋細胞を用いてp94がNa^+により活性化を受けるかどうかを検討した。培養骨格筋細胞にNa^+チャネルイオノファー(monensin)あるいはNa^+ポンプの阻害剤(ouabain)を用い、筋細胞内のNa^+濃度を上昇させると、薬剤濃度依存的に全長のp94が消失し、50-60kDa付近にp94の自己消化断片を検出することができた。一方、p94の酵素活性能を持たないノックインマウス由来の筋細胞においては薬剤濃度に関わらず、p94の自己消化断片は検出されず、全長のp94のみが検出できた。これらの結果は培養骨格筋細胞において、細胞膜を通過してきたNa^+によってp94は活性化し、自己消化断片を生じること示している。(2)に関しては、活性化したp94により切断される分子を探索するために、薬剤処理を行った培養骨格筋細胞試料とコントロールの試料を二次元電気泳動に供し、p94の活性化前後における変動する電気泳動スポットを解析した。その結果、p94活性化前後において増減するタンパク質のスポットはいくつか確認できた。これらのスポットを回収してin gel digestionを行った後、MALDI-TOF/TOF質量分析装置を用いてスポットに含まれるタンパク質の同定を行ったが、スポット中に含まれるタンパク質の量が非常に微量であるため同定するまでには至っていない。今後はタンパク質同定のための技術的な手技の向上ならびに二次元電気泳動以外の方法を用いた解析方法の検討が必要である。
すべて 2006
すべて 雑誌論文 (1件)
Journal of Biological Chemistry 281
ページ: 18519-18531
