|
当該年度では、SELEX技術をベースとした天然アプタマーの探索システムを確立するための基礎技術となる、RNAプールならびに標的蛋白質の調製方法、選別されたRNAの増幅方法について手法の確立、ならびに条件の最適化をおこなった。以下に、具体的内容を列挙する。
1.RNA初期プールとなるヒト(HeLa)培養細胞の全RNAを調製する行程の最適化をおこなった。
2.標的蛋白質の普遍的発現ベクターとして両末端アフィニティタグ化コンストラクトの作製、ならびに、小麦胚芽抽出液をもちいたin vitro翻訳による標的蛋白質調製法の最適化をおこなった。
3.選別されたRNAの増幅方法として、以下の一連の行程の確立・最適化をおこない、鎖長や配列、5'-末端キャップ構造等に依存せず、天然のRNAが効率よく増幅されるような条件を確定した。
(1)選別されたRNAの5'末端を脱リン酸化する。
(2)RNAの3'-末端へ、ライゲーションによって逆転写用プライマー配列(リンカーを介してPCR用フォワードプライマー配列がタンデムにつながっている)を付加する。
(3)逆転写とRNA分解によって、一本鎖cDNAを調製する。
(4)自己ライゲーションによってcDNAを環状化し、これを鋳型としてPCR増幅をおこなう。
4.鎖長の違いに由来するPCR増幅効率のバイアスを低減させる方法として、単一プライマーによる増幅手法(HANDS法:Homo-tag Assisted Non-Dimer System)の条件の最適化をおこない、鎖長の異なった配列(100塩基以下〜400塩基以上)を等しく増幅させる条件を確定した。
|
