| 研究概要 |
本研究では、ハトなどある種の鳥類が生物種特異的に発現するα-1,4-ガラクトース転移酵素(以下α-1,4-GalTと略す)の遺伝子を発現クローニングにより同定し、生物種特異的な糖鎖がどのようなメカニズムで構築されたのか遺伝子レベルで解析することを目的としている。本年度は単離したcDNAの遺伝子発現を行い、in vitro(細胞外)およびin vivo(細胞内)において、その酵素活性を測定して基質特異性を解析した。
1.可溶性組換体の作製とハトα-1,4-GalTのin vitroの基質特異性の解析
酵素の活性部位をコードすると推定されるC末端側の領域をPCRによって増幅し、哺乳動物発現用のベクター(pFLAG-CMV)に組み込んだ。293T細胞で可溶性のα-1,4-GalTを大量に発現させ、培養上清から可溶性のα-1,4-GalTを抗FLAG抗体カラムで精製した。Galβ1-4Glc(NAc)を非還元末端に持つ糖鎖に対し、この酵素はGalをα-1,4-の結合様式で転移させることをHPLC、NMR、およびメチル化分析により確認した。また、様々な構造の糖鎖を基質として、3[H]-標識したUDP-Galを用いて酵素活性を測定し、この酵素の基質特異性を決定した。
2.哺乳動物細胞内におけるハトα-1,4-GalTのin vivoの基質特異性の解析
全長をコードするハトα-1,4-GalTを293T細胞に発現させると、細胞表面上にGalα1-4Galが発現することをFACSにより確認した。また、このGalα1-4Galは、糖タンパク質上の糖鎖に存在することをウェスタンプロット法により確認した。
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