| 研究概要 |
本研究では、ハトなどある種の鳥類が生物種特異的に発現するα-1, 4-ガラクトース転移酵素(以下α-1, 4-GalTと略す)の遺伝子を発現クローニングにより同定し、種特異的な糖鎖がどのようなメカニズムで構築されたのか遺伝子レベルで解析することを目的としている。本年度は単離したハト由来cDNAの配列と相同性のある遺伝子をヒトやニワトリから単離して発現を行い、in vivo(細胞内)およびin vitro(細胞外)において、その酵素活性を測定して基質特異性の比較解析を行った。
1. 乳動物細胞内におけるハト、ヒト、ニワトリα-1, 4-GalTのin vivoの基質特異性の比較解析
全長をコードするハトα-1, 4-GalTを293T細胞に発現させると、細胞表面上にGalα1-4Galをもつ糖タンパク質が発現することをFACSおよびウェスタンブロット法により確認した。一方、ヒトおよびニワトリα-1, 4-GalTを同様に発現させるとGalα1-4Galは、糖脂質上の糖鎖に存在することをFACSにより確認した。すなわち、ハトα-1, 4-GalTはヒトやニワトリ由来のものと基質特異性が異なることを明らかにした。
2. 可溶性組換体の作製とハト、ヒト、ニワトリα-1, 4-GalTのin vitroの基質特異性の比較解析
酵素の活性部位をコードすると推定されるC末端側の領域をPCRによって増幅し、哺乳動物発現用のベクター(pFLAG-CMV)に組み込んだ。293T細胞で可溶性のα-1, 4-GalTを大量に発現させ、培養上清から可溶性のα-1, 4-GalTを抗FLAG抗体カラムで精製した。Galβ1-4GlcNAcを非還元末端に持つ糖鎖に対し、ハト由来の酵素はヒトやニワトリ由来のものと比べ10倍くらい高い活性でGalを転移した。
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