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当初研究計画に従って、下記の研究結果を得た。
下記番号は研究目的・研究実施計画書の番号に対応させた。
1.Na^+非結合型NtpKリングのX線結晶構造解析-精製したNtpKリングにDCCDを反応させNa^+結合に重要なグルタミン酸残基を修飾することにより、Na^+結合能が大幅に減少していると考えられる。この状態で結晶化に成功し、解像度2.8ÅでX線結晶構造を明らかにした。得られた構造はNa^+結合に重要なグルタミン酸残基にDCCDが共有結合していた。これにより、DCCDの阻害機構が明らかになった。しかし、得られた構造もNa^+結合型であった。
2.阻害剤結合型NtpKリングのX線結晶構造解析-本酵素はPa1AというV-ATPaseの特異的阻害剤により阻害される。この阻害剤とNtpKリングとの共結晶化のスクリーニングを行い、解像度2.8Åでのデーターセットを得ることに成功した。今後はX線結晶構造解析を行い、Pa1Aによる阻害機構を明らかにする。
3.真核細胞V型ATPaseのロータリーリングのX線結晶構造解析-前年度ヒト由来cサブユニットをクローニンングし、大腸菌無細胞系を用いて発現させ、有機溶媒中での精製系を立ち上げたが、最終精製量は少なかった。有機溶媒抽出の方法を検討した結果、10倍以上の回収率で精製することに成功した。今後はリングを形成する条件を見つけ、結晶化・X線構造解析を目指す。
4.生化学実験-精製したNtpKリングを用いて各種条件下で22Na^+結合を測定した。NtpKリングのみでも複合体と同様に22Na^+を結合することを明らかにした。
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