骨格筋におけるカルパインシステムの役割と制御機構の解析

2006 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18770124
• 研究機関: (財)東京都医学研究機構
• 研究代表者: 小野 弥子 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (20392376)
• キーワード: カルパイン / p94 / カルパイン3 / 骨格筋 / タンパク質分解 / タンパク質発現系 / プロテオーム解析 / LC-MS / MS / 分解断片の定量

研究概要

(1)二重変異マウスの解析 活性中心残基への点変異導入によりプロテアーゼ活性のみを失活させたp94を発現するノックインマウス(p94:KI)マウスとコネクチンmdm変異マウスを掛け合わせて作製した二重変異マウスについて、そのジストロフィー症状を解析した。mdm変異によってP94が自己消化活性非依存的に不安定化・減少することを見出したが、この実体についてさらに解析中である。
(2)コネクチン、MARPsの分解様式についての解析 Sf-9細胞にp94(野生型及び活性減弱変異体)とコネクチンを共発現させる、という方法で、コネクチンがp94の基質となりうると同時にp94の構造安定化効果を持ちうることを示唆する結果を得た。これまで、p94について基質分解活性を測定するのに適した精製酵素標品を得ることは困難であったが、その目的に適した変異体を複数同定し、発現に必要なコンストラクトを準備した。また、大腸菌に発現させ精製したコネクチン断片及びMARP2について、μ-カルパインによる切断部位を同定しているが、p94による切断部位を同定することが必要である。μ-カルパインによって生成する分解断片に対応する発現コンストラクトを作製し、コネクチン-MARP間相互作用への影響を解析した。
(3)iTRAQ、LC-MS/MSによる基質検索 COS細胞に野生型p94または不活性なp94:C129S変異体を発現し、それぞれの細胞グループにおけるタンパク質の量的変化を解析した。基質の分解を検討する定法として、これまではSDS-PAGE/ウエスタンブロットを用いてきたが、異なる検出原理・感度によってp94の基質となるタンパク質を再度検索することを目的とした。その結果、p94の自己消化の様子(分子の全体が速やかに減少していく)と基質と考えられるタンパク質の量的変化(そのタンパク質に由来するペプチドの一部が特に減少する)に興味深い違いが見出された。

研究成果

• [雑誌論文] Comprehensive survey of p94/calpain 3 substrates by comparative proteomics -Possible regulation of protein synthesis by p94. (2007)
  • 著者名/発表者名: Ono, Y., Hayashi, C., Doi, N., Kitamura, F., Shindo, M., Kudo, K., Tsubata, T., Yanagida, M., Sorimachi, H.
  • 雑誌名: Biotech. J. (in press)
• [雑誌論文] Suppressed disassembly of autolyzing p94/CAPN3 in a genetic reporter system. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ono, Y., Torii, F., Ojima, K., Doi, N., Yoshioka, K., Kawabata, Y., Labeit, D., Labeit, S., Suzuki, K., Abe, K., Maeda, T., Sorimachi, H.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 281 ページ: 15219-15231
• [雑誌論文] How do defects in proteolytic functions of skeletal muscle-specific calpain, p94/calpain 3, cause calpainopathy/LGMD2A? (2006)
  • 著者名/発表者名: Sorimachi, H., Ojima, K., Yanagida, M., Ogawa, H., Hayashi, C., Doi, N., Ono, Y.
  • 雑誌名: Neuromuscul. Disord. 16, suppl. ページ: 148
• [雑誌論文] Relationships between p94/CAPN3 and N2A connectin/titin in skeletal muscle under the normal and dystrophic conditions. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ono, Y., Ojima, K., Doi, N., Hayashi, C., Torii, F., Yoshioka, K., Labeit, D., Labeit, S., Suzuki, K., Abe, K., Maeda, T., Sorimachi, H.
  • 雑誌名: Neuromuscul. Disord. 16, suppl ページ: 72
• [雑誌論文] Spatio-temporal expression of muscle-specific calpain, p94/calpain 3, during myogenesis. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ojima, K., Ono, Y., Doi, N., Labeit, S., Sorimachi, H.
  • 雑誌名: Neuromuscul. Disord. 16, suppl ページ: 56
• [雑誌論文] Effect of N2A connectin/titin on disassembly of p94/CAPN3 caused by auaolysis in IS2. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ono, Y., Torii, F., Ojima, K., Doi, N., Yoshioka, K., Labeit, D., Labeit, S., Suzuki, K., Abe, K., Maeda, T., Sorimachi, H.
  • 雑誌名: FEBS J. 273, suppl. ページ: 50