| 研究概要 |
シトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)はその分子多様性から酵素的化学品合成、いわゆるバイオプロセスへの応用が期待される生体触媒である。しかし一方で、反応機構の複雑さゆえに実生産に資する高活性を得るのは容易ではなく、応用例も一握りである。P450はレドックスパートナーとの相互作用を必要とし、またその宿主微生物の異化代謝から供給される還元力の供給が求められるなど、酵素自身に加えそれが機能する細胞内外の環境が反応性に大きな影響をおよぼす。これら酵素を取り巻く反応場、すなわち触媒微生物中のボトルネック因子を解明し、これを解除するため、大腸菌1遺伝子破壊株ライブラリーを宿主とした網羅的スクリーニングによる律速因子同定に取り組んでいる。モデル酵素として7-エトキシクマリンの脱エチル化反応を触媒するStreptomyces coelicolor由来P450を選択した。酵素反応産物である7-ヒドロキシクマリンは蛍光定量が可能であり、これによりハイスループットな活性測定系が確立できるためである。目的酵素遺伝子の発現用プラスミドベクターを構築し、野生型株において上記アッセイ法によって活性の発現を確認した。次いでライブラリーを構築する約4,000の1遺伝子破壊株に対して、ヒートショック法による形質転換を実施した。形質転換用培養で生育の優れなかった約30株を除く全ての破壊株に目的酵素遺伝子の導入を完了させた。得られた形質転換体群について、現在蛍光強度測定ならびにHPLC分析によるスクリーニングを実施中であり、すでに野生型株に対して1.5〜2倍程度にまで比活性が向上した変異株をいくつか見出している。
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