|
市販のキシラナーゼを用いて、アプタマーのスクリーニング法を検討した。
60bのランダム配列有する一本鎖DNAを合成した。特異的プライマーを用いて非対称PCRで増幅し初期オリゴ核酸ライブラリとした。市販のキシラナーゼをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した後、エレクトロブロッティングによりPVDF膜に転写した。
PVDF膜に初期オリゴ核酸ライブラリをインキュベートし、一本鎖DNAを吸着させた。洗浄の後、CBB染色によりキシラナーゼのバンドを可視化し、そのバンドを含むPVDF膜を切り出した。PVDF膜をPCRチューブに入れ、特異的プライマーを用いてPCR増幅した後、非対称PCRを行い、一本鎖DNAを増幅した。
PVDF膜への吸着、PCR増幅を数回繰り返し、キシラナーゼに吸着するアプタマーを得た。
キシラナーゼに対する特異性を検討するために、FITC標識されたプライマーを用いて非対称PCRを行い、FITC標識アプタマーを調製した。FITC標識アプタマーをキシラナーゼを転写したPVDF膜にインキュベートしたところ、キシラナーゼのバンド位置から蛍光が観察された。このことから、得られたアプアタマーはキシラナーゼに高い特異性を持つことが確認された。
|
