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枯草菌由来転写因子であるLmrA、YxaF、およびYsiAはいずれもTetRファミリーに属するが、LmrAとYxaFはフラボノイドに応答性を示すのに対し、YsiAは長鎖アシルCoAを認識して標的遺伝子の結合領域から解離し、発現誘導を引き起こす。これらの転写因子のエフェクター認識部位を決定し、さらにエフェクター特異性を改変することを目指して種々の変異体を作製して解析を行った。
当初in vivoスクリーニング系を構築してランダム変異ライブラリーからの選別を計画したが、研究開始時にYxaFとYsiAの立体構造が明らかになっていたので、これらの情報をもとに認識に重要な残基を予想し、それらに変異を導入してin vitro解析を行うことから着手した。YsiAに関して、R116、R150、R153、K173がCoA部分と作用すると予想し、これらをアラニンに置換した変異型YsiAを作製し、標的DNAとの結合能と長鎖アシルCoAに対する応答性をゲルシフト解析によって評価した。その結果、いずれの変異型YsiAも野生型と同程度のDNA結合能を有していたが、R150Aでは長鎖アシルcoAを添加してもDNAから解離しにくくなった。これによりR150が認識に重要であることが示された。またYxaFに関して、D75、F87、W131、F135、R137、K138、L139、E141がエフェクター分子と相互作用すると予想し、これらをアラニンに置換した変異型YxaFを作製し、標的DNAとの結合能とフラボノイド応答性を同様の手法にて評価した。その結果、W131AのDNA結合能は野生型よりも低下していたがそれ以外の結合能は同程度であり、またいくつかは野生型とは異なる認識プロファイルを示した。特にF87Aではフラボノイド応答性が著しく低下しており、フラボノイド認識に主要な役割を果たすことがわかった。
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