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本研究では、神経細胞の神経突起伸長におけるNa^+/K^+/2Cl^-共輸送体の機能に着目し、Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体によるクロライドイオンの細胞内への取り込みと、神経突起伸長との関連を検証し、以下の事を明らかにした。研究にはラット副腎由来PC12細胞およびPC12D細胞を用いた。これらの細胞は神経成長因子(NGF)処理によって、神経細胞様に神経突起を伸長する(PC12D細胞の方が、より敏速に突起を伸長する)。
・神経突起伸長時のNa^+/K^+/2Cl^-共輸送体の発現、活性、局在の変化
PC12D細胞にNGF刺激を与えた際に、Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体の発現量に変化が見られるかをウエスタンブロッティング法で検証したところ、Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体のタンパク質発現量はNGF刺激により約2倍に増加していた。また、Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体は、NGF刺激により伸長した神経突起の先端部分(成長円錐)に多く局在していた。
・神経突起伸長に対するNa^+/K^+/2Cl^-共輸送体の阻害効果
PC12D細胞にNGF刺激を与える際に、Na^+/K^+/2Cl^-共輸送体の特異的阻害剤であるBumetanideを作用させたところ、神経突起の伸長は有意に抑制された。また、クロライドイオン濃度が低い培養液中でNGF刺激を与えたところ、神経突起の伸長は有意に抑制された。さらに、RNAi法を用いてNa^+/K^+/2Cl^-共輸送体をノックダウンしたところ、NGF処理による神経突起伸長は劇的に阻害された。
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