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(1)膵β細胞におけるcAMP compartmentの存在を明らかにする目的で、Epac2のN末端をCFPで、C末端をYFPで標識したFRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer蛍光共鳴エネルギー移動)プローブを作製した。このEpac2 FRETプローブをインスリン分泌細胞株MIN6に導入発現させ、forskolinで刺激したところ、細胞内cAMPレベルの上昇を感知したことから、このプローブはFRETプローブとして機能することが証明された。
(2)蛍光タンパク質Venusで標識したヒトプレプロインスリン(インスリンVenus)を初代培養膵β細胞に導入し、インスリン分泌顆粒の動態(ダイナミクス)を全反射蛍光顕微鏡を用いて解析する方法を確立した。
(3)インスリンVenusを用いて、種々の刺激によるインスリン分泌顆粒の開口分泌過程を詳細に検討したところ、分泌顆粒動態の特性によりold face、resting newcomer、restless newcomerの3種類の様式に分類された。Ca^<2+>単独刺激ではold faceが主要な開口分泌の様式で、グルコース刺激では一過性の早期相および持続的な後期相のいずれも大部分はrestless newcomerによる開口分泌であった。開口分泌に重要なcAMPシグナルによるインスリン分泌顆粒動態について解析したところ、cAMP単独刺激によって顆粒の細胞膜へのrecruitmentは促進されたが、fusionは殆ど惹起されなかった。しかしながら、グルコース刺激と組み合わせると、fusion部位の増加とともにrestless newcomerが顕著に増加した。
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