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今年度の目標は1.検出されたウイルスDNA末端配列の検討、2.逆転写酵素の同定であった。以下にこれまでの実績を記す。
1.検出されたウイルスDNA末端配列の検討:現在RACE法と細胞内にVSVの配列を導入することにより末端配列を検討している。RACE法は市販のキットを用いてVSV感染細胞からDNAを精製し、プロトコールに従い実験を行っている。現在は末端の処理(RNaseなど)にっき検討している。細胞内にVSVの配列を導入する方法は、VSV配列を組み込んだレトロウイルスベクターの作製、細胞への導入まで済んでいる。
2.逆転写酵素の同定:ヒトレトロトランスポゾンであるLINE-1を、VSV DNAが検出されない細胞株に導入しVSVを感染させたところ、VSV DNAが検出される。また、LINE-1の逆転写酵素活性を欠失させたmutantではVSV DNA合成が検出されない。LINE-1がVSV DNA合成に関与している可能性が高くsiRNAを導入しVSV DNA合成量が減少するか確認した。LINE-1を導入した細胞株にLINE-1特異的なsiRNAを作用させVSVを感染させたところ、コントロールsiRNAに比べ明らかにVSV DNA合成量の低下が見られた。現在はLINE-1を導入した細胞株とマウスレトロウイルスを導入した細胞株、何も導入しなくてもVSV DNA合成が認められる細胞株の3種類を用いて様々な逆転写酵素阻害剤の効果を確認している。この結果により実際のVSV DNA合成が細胞内のどの逆転写酵素を用いるのかを予想出来る。また`レトロウイルス以外のRNAウイルスもヒト細胞内で逆転写されるという本課題の阻害剤が見つかれば、本現象により引き起こされる可能性がある全身エリテマトーデスなどの治療薬となりうる。
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