| 研究概要 |
BLNKはB細胞抗原受容体(BCR)を介して誘起されるB細胞活性化において非常に重要な役割を担うアダプター分子である。研究代表者は、BLNKのN末端に存在するロイシンジッパー構造がBLNKの機能発現に重要であることを見いだしている。そこで、BLNKロイシンジッパー構造とGSTとの融合蛋白質を用いた親和性カラムを作製し、ニワトリDT40細胞においてBLNKロイシンジッパー構造と特異的に結合するp90及びp110の二つのチロシンリン酸化蛋白質を分離、精製した。これらの蛋白質分画に対応するペプチド断片の解析を行い、p90及びp110蛋白質をコードする遺伝子配列を既存のデータベースより取得した。その情報牽基にPCR法を用いて全長のcDNAをクローニングし、これらの全長cDNAにFLAGタグを付加した発現プラスミドを構築し(p90-FLAG, p110-FLAG)、これをDT40細胞株に導入した。BCR刺激前後のDT40細胞抽出物からp90-FLAG並びにp110-FLAGを抗FLAG抗体を用いて免疫沈降後、抗BLNK抗体を用いたイムノブロッティングを行い、P90やP110とBLNK間の細胞内での結合を確認する事ができた。
次にcDNAの情報を基に合成したオリゴプライマーを使用して、DT40細胞のゲノム抽出物からPCRを行い、P90及びp110をコードするエクソンを含むゲノム増幅断片をクローニングした。得られたゲノム断片よりターゲティングベクターを構築し、DT40細胞に導入後、薬剤存在下での培養により耐性クローンを選択し、ヘテロ相同組換え体を得た。現在、異なる薬剤選択マーカーを付与したターゲティングベクターを用いて、両対立遺伝子が破壊された細胞を単離することを試みている。
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