| 研究概要 |
(1)トランスジェニックマウスを用いたヒトSIM2及びマウスSim2遺伝子のプロモーター解析
ヒトおよびマウスSIM2遺伝子発現の転写制御機構について培養細胞を用いて行ってきたが今回、トランスジェニックマウスを用いin vivoにおけるヒトSIM2遺伝子プロモーター解析を行った。ヒトSIM2遺伝子プロモーター領域約2.2kbの断片をβ-ガラクトシダーゼ(β-Gal)発現ベクターに組み込み、マイクロインジェクション法にて受精卵へ導入後、発生初期胎仔のwhole-mount組織切片およびβ-Gal染色による解析をした。9.5日胚において前肢芽先端,原始腸管付近からレポーター発現が見られ始め、E10.5胚において前肢芽先端,原始腸管以外に耳原基付近,後肢芽先端に発現が観察された。この発現はファウンダーの異なるトランスジェニックマウスにおいても同様に観られたが、予想された発生初期脳や腎臓などには検出されなかった。
(2)SIM1、SIM2タンパクと相互作用するタンパクの同定
SIM2タンパクとのヘテロダイマー形成のパートナーと推測されているARNT及びARNT2との二量体形成ドメイン部位の決定を免疫沈降法さらにウエスタンブロッティング法を用いて解析した。様々なタグと融合したSIM2、ARNTおよびARNT2タンパクをHEK293細胞内でcotransfectionし、一過性に発現させた後タグ抗体およびSIM2抗体で免疫沈降し、SIM2-ARNTおよびSIM2-ARNT2がそれぞれ共沈した。さらにSIM2タンパク質の種々の機能ドメインを欠失したプラスミドを用いて同様に解析したところ、SIM2-ARNT2ではPAS2ドメインのみが必須であったが、SIM2-ARNTではPAS2とPAS1ドメインが必須であった。このようなタンパク相互作用に必要な機能ドメインの違いが標的遺伝子発現とどのように関わるかは、今後の研究課題である。
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