| 研究概要 |
この研究において自己炎症性疾患制御因子Ttc7がヒトアトピー性皮膚炎発症に関与しているかを調べる。そのためヒトTtc7の多型の有無の検索が必要である。
1)末梢血、培養細胞からのRNAおよびgenomic DNAの調整
ヒト末梢血10mlを採血し、Lymphoptrep tubeを用いて末梢血単核球を分離した。これら細胞からTrizol LSを用いてtotal RNAを抽出し、ヒト細胞培養293T細胞においては10cmディッシュからTrizolを用いてtotal RNAを抽出した。同時にgenomic DNAの抽出も行った。
2)RT-PCR法の確立とシークエンス法による多型の検索
1〜3μg total RNAからsuperscript first-strand kitを用いてoligo-dT primed first strandを作製した。RT-PCRにてTtc7遺伝子のcoding領域を覆うPCR断片を増幅するため、様々なprimer pairを作製し、チェックした。そのうち、330F x 1200R,1030F x 1880R,1610F x 3060Rの組み合わせにてTtc7遺伝子のcoding領域をカバーすることができた。これらRT-PCR断片をdirect sequenceし、多型の有無を解析した。また多型の存在を再確認するため、RT-PCR断片をTA-cloningし、再度sequenceした。現在9名の研究員より末梢血を入手しsequenceを決定した結果、1カ所のmissense多型と、2カ所のsilent多型の存在を確認している。
今後はこれらの多型が、コントロール群と比較して、アトピー性皮膚炎、乾癬といった患者に集積しているか否かを確認する予定である。
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