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Kf-1のユビキチンリガーゼ活性を調節する相互タンパク質の探索を開始した。ユビキチンリガーゼ活性に重要なRINGドメインを含むC末端をbaitとして、この部分と相互作用するタンパク質をyeast two hybrid法により探索した結果、カルモジュリン、SKP1及びBAP1が同定された。これらタンパク質との相互作用を確認するため、in vitro pull down assay及び免疫沈降法(in vivo)にて検討した。In vitro pull down assayはGSTタグ付きhKf-1(GST-hKF-1)にHEK293細胞の細胞抽出液を反応させた。免疫沈降法はHEK293細胞に過剰発現させたV5-His_6標識hKf-1をV5抗体で免疫沈降した。Kf-1とカルモジュリン、SKP1及びBAP1との結合はイムノブロット法で同定した。その結果、in vitro及びin vivoともに、いずれのタンパク質もKf-1との相互作用が認められなかった。一方、Kf-1が小胞体に局在するユビキチンリガーゼであることから、逆行輸送の構成タンパク質であるVCP(p97)が結合している可能性が考えられた。そこでVCPとの結合を同様の操作で検討した。しかしながらKf-1とVCPの結合は認められなかった。In vivo pull down assayでKf-1に結合しているタンパク質を銀染色にて可視化した結果、複数のタンパク質が認められた。その中で分子量約27kDaのタンパク質が大量に結合していることが明らかとなった。現在このタンパク質を質量分析によって解析しようと計画している。
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