| 研究概要 |
(1)細胞培養
ヒト唾液腺多形性腺腫より樹立したSMAP1/4および転移能のことなるヒト腺様嚢胞癌由来細胞ACC2/Mの各細胞系を、通常の培養条件(10%FCS,5%CO_2)で5Daysまで培養後、低酸素郡では、条件(1%O_2/5%CO_2/94%N_2)下で、5時間培養した。その後遺伝子発現の検索のためにアイソジェンにて回収した。
(2)遺伝子発現の検索
上記各種細胞株より、RNAを抽出し、RT-PCR法にて、各以下の分子のmRNA発現量を測定して遺伝子発現状況を検索した。HIF-1aの発現に関しては、細胞種間および培養条件による優位な発現レベルの差はみとめられなかった。しかし細胞種間の発現レベルにおいて、HIF-1aのdegradationに関与しているpVHLの発現レベルがACCに比べて、SMAPで低く、逆にHIF-1aにより増幅されるといわれている血管内皮増殖因子であるVEGFの発現レベルが高い傾向がみられた。また培養条件では、腺様嚢胞癌由来細胞で高転移性細胞株であるACCMおよび多形性腺腫由来で導管上皮細胞性格をもつSMAP1で、低酸素下でVEGFの発現レベルが高い傾向がみられた。
(3)がん関連遺伝子変異の検索
各種細胞株から、通法にてゲノムDNAを抽出し、フェノール・クロロホルム法により精製し、PCR法にてがん関連遺伝子であり、HIF-1aのdegradationに関与しているp53について、exon5-7ごとに増幅し、アガーロスゲル電気泳動で増幅産物を確認後、PCR産物をカラム精製し、ダイレクトDNAシークエンス法にて、がん関連遺伝子の変異を確認した。SMAP1/4の細胞系で、p53遺伝子エクソン7のコドン249の1塩基欠失(AGG→AG-)がみいだされた。
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