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1.コラゲナーゼ処理による細胞シート化
伸縮性コラーゲンをコラゲナーゼで消化して細胞シートを得るための(1)コラゲナーゼ処理条件、(2)コラゲナーゼ処理が細胞機能に与える影響を評価した。(1)についてはコラーゲン重量(mg)に対して50U/mgのコラゲナーゼ濃度で処理したときに最も効率よくコラーゲンを分解できた。(2)については50U/mgのコラゲナーゼ濃度で処理したときの細胞機能を評価した。その結果、細胞増殖性とアルカリフォスファターゼ(ALP)活性はコラゲナーゼ処理後も未処理と同等に維持されていた。また、免疫染色法の結果、細胞骨格タンパク質Actinは細胞全体に広がり細胞骨格を維持していた。また細胞間結合タンパク質βCateninは他の細胞と結合している細胞周辺部に存在しており、細胞間結合が維持されていた。以上より、コラゲナーゼ処理条件を50U/mgと決定し、その条件は細胞の機能に影響がないことを確認した。
2.細胞シートの重層化による人工歯根膜の作成
歯根膜細胞シートの作成とその重層化を検討した。まず歯根膜細胞シートを得るための培養条件を検討した結果、培養7日目以上でシームレスな細胞シートを得ることができた。次に培養7日目に得た細胞シートを3枚重層しミニ歯根膜組織の作成を試みた。その結果、重層後1日目に3重シートは一体化しミニ組織を作成することに成功した。また重層後の細胞機能を評価した結果、重層後7日目においてALP活性等の機能が低下していた。さらにミニ組織の切片を観察した結果、組織内部において壊死が起こっていた。栄養・酸素供給の限界が起きていると推定し、内部組織に毛細血管系を導入する検討を行っている。
3.伸縮性コラーゲン担体を用いた伸展培養
上記の内部壊死問題が明らかとなったため、伸展培養条件の検討をH19年度に持ち越した。現在、血管内皮細胞と歯根膜細胞を共培養し、血管新生条件を検討している。また、伸展培養条件も同時に検討中である。
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