SOD1タンパクの修飾検出による筋萎縮性側索硬化症の原因究明と新規診断法開発

2006 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18890112
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 村上 哲郎 岡山大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (70403475)
• キーワード: 筋萎縮性側索硬化症 / 神経変成 / SOD1 / 不溶化凝集

研究概要

筋萎縮性側索硬化症のの原因遺伝子である変異SOD1を発現するトランスジェニックマウスの脊髄を用いて、各種の界面活性剤(Tris、Triton、SDS、Urea)に対する可溶性の差を利用したタンパクの分画を行った。すなわち、変異SODI遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスから脊髄を摘出し、Trisバッファー内にて粉砕した。その後超遠心分離機を用いて遠心し、上清(可溶性分画)および沈殿(不溶性分画)とに分けた。さらに沈殿をTritonバッファー内で粉砕し、再び超遠心分離機を用いて上清(可溶性分画)および沈殿(不溶性分画)とに分けた。これをSDSおよびUreaバッファーを用いて順に繰り返し、計4種の界面活性剤によって処理した。その結果、変異SODI遺伝子を発現するトランスジェニックマウスでは不溶性分画に最後まで残る沈渣(ペレット)が得られたが、正常型(野生型)SOD1を発現するトランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックマウスでは確認できるペレットは得られなかった。次に、この不溶性分画をPVDF膜上に一次元電気泳動によって展開し、抗SOD1抗体を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、変異SOD1遺伝子を発現するトランスジェニックマウスでのみ、ureaに初めて可溶性を示す分画にSOD1タンパクが存在し、,変異SOD1タンパクは実際にトランスジェニックマウスの脊髄で不溶化し蓄積していることが判明した。
さらに、不溶性分画に存在するタンパクを網羅的に解析するために、二次元電気泳動装置を用いてurea可溶性分画を展開して検討したところ、複数のスポットが得られた。これらは変異SOD1トランスジェニックマウス脊髄に蓄積している新規タンパクである可能性が高く、現在マススペクトロメトリーにてタンパクの同定と修飾について検討を行っている。

研究成果

• [雑誌論文] PINK1, a gene product of PARK6, accumulates in α-synucleinopathy brains. (2007)
  • 著者名/発表者名: Murakami T, et al.
  • 雑誌名: Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry (in press)
• [雑誌論文] Cortical neuronal and glial pathology in TgTauP301L transgenic mice : neuronal degeneration, memory disturbance, and phenotypic variation. (2006)
  • 著者名/発表者名: Murakami T, et al.
  • 雑誌名: American Journal of Pathology 169(4) ページ: 1365-1375
• [雑誌論文] Intrathecal injection of epidermal growth factor and fibroblast growth factor 2 promotes proliferation of neural precursor cells in the spinal cords of mice with mutant human SOD1 gene. (2006)
  • 著者名/発表者名: Ohta Y, Murakami T, et al.
  • 雑誌名: Journal of Neuroscience Research 84(5) ページ: 980-992
• [雑誌論文] Enhanced accumulation of tau in doubly transgenic mice expressing mutant betaAPP and presenilin-1. (2006)
  • 著者名/発表者名: Samura E, Murakami T, et al.
  • 雑誌名: Brain Research 1094(1) ページ: 192-199
• [雑誌論文] Parvalbumin and calbindin D-28k immunoreactivity in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene. (2006)
  • 著者名/発表者名: Sasaki S, Murakami T, et al.
  • 雑誌名: Brain Research 1083(1) ページ: 196-203