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1.マウス歯胚由来幹細胞の分取
我々が所存しているマウス由来の歯髄細胞株中に歯髄幹細胞が存在することをHoechst33342を用いてFACS cell sorter機器を使用して確認し、幹細胞分取に成功した。また、幹細胞の培養を行い、再びFACS cell sorter機器を用いて測定したところ、多くの幹細胞の存在を確認できた。
2.幹細胞のキャラクタリゼーション:多分化能の詳細な証明
幹細胞の性質である多分化能の詳細な確認を行った。石灰化誘導実験において、誘導可能な培地の下で培養後、ALP活性およびvon Kossa染色にて判定を行った結果、幹細胞群はALP活性の促進およびvon Kossa染色に対して強い陽性反応を示した。また、培養終了後total RNAを分離し、cDNA合成を行い、骨芽細胞分化マーカーであるOsteocalcin、Osteonectin、Runx2の発現をReal-time PCRにて定量した結果、それぞれ多い発現量を示した。次に、脂肪誘導実験を行い、Oil Red O染色にて判定および培養終了後のtotal RNAより合成したcDNAを用いて、PPARγをReal-time PCRにて定量比較した。その結果、幹細胞が脂肪滴を含んだ脂肪細胞へ変化し、Oil Red O染色に対しても陽性反応を示し、PPARγの発現も強く現れた。神経誘導実験では、培養後、ニューロンおよびグリア細胞様の形成を実体顕微鏡にて確認した。また培養後、タンパク質を分取し、Neurofilamentの発現をWestern blot法にて解析した結果、Neurofilamentタンパクの発現が確認できた。次にBMP2およびBMP4を含んだ培地で培養後、象牙芽細胞分化マーカーであるDmp1、Dsppなどの発現を半定量的PCR法かつReal-time PCRにて比較した結果、幹細胞群において強い発現が確認された。
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