|
タンパク質間相互作用を標的とした創薬は近年新しい概念として注目されており、生きた細胞内の環境下で創薬の候補ペプチドや化合物を簡便にスクリーニングできる手法の開発が求められている。そこで本研究ではレポーター分子としてシグナル伝達分子を用い、細胞内のタンパク質間相互作用に伴う細胞の「増殖」の有無を検出する新しい技術の確立を目指した。
これまでに、細胞膜局在により活性化できるシグナル伝達分子SOSを用いた系について原理は実証済みであったが、ライブラリーから有用な結合性分子をスクリーニングできるかどうかについては検証していなかった。そこで、緑色蛍光タンパク質GFPをモデルタンパク質として、それに結合する細胞内抗体をスクリーニングする実験を行った。まず、GFPとSOSを融合したキメラタンパク質、および細胞内抗体ライブラリーを細胞膜局在モチーフ配列と融合したキメラタンパク質をコードする遺伝子を設計した。これらをレトロウイルスベクターに組み込み、細胞に遺伝子導入した。この際、GFP-SOS安定発現細胞を先に樹立したのち、細胞内抗体ライブラリーを導入した。細胞を培養した結果、GFPと細胞内抗体の相互作用に起因して増殖する細胞が得られたことが示唆された。そこで、増殖した細胞を回収して細胞内抗体遺伝子の配列を解析したのち、GFPへの結合解析を行った。その結果、標的抗原であるGFPに高い親和力で結合する細胞内抗体を取得できていることが分かった。
|
